專利名稱：大腸桿菌o157:h7核酸適體及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸適體，特別涉及大腸桿菌0157:H7核酸適體及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織最新報(bào)道，全球每年發(fā)生腹瀉的病歷數(shù)高達(dá)15億，由此造成了百萬(wàn)兒童死亡，其中70%的病例歸咎于各種污染食品的微生物。大腸桿菌是最常見(jiàn)的食源性病原微生物，而其中的0157:H7型是一種強(qiáng)致病性的病原菌，該種病原菌常見(jiàn)于牛等溫血?jiǎng)游锏哪c內(nèi)，可通過(guò)水和未加工熟的食物感染人。該型的大腸桿菌會(huì)釋放一種強(qiáng)烈的毒素，引起患者出現(xiàn)嚴(yán)重的水瀉、帶血腹瀉、發(fā)燒、腹絞痛及嘔吐，情況嚴(yán)重時(shí)，更可能并發(fā)急性腎病甚至敗血癥。5歲以下的兒童出現(xiàn)該等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)較高。目前該類病原菌的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫法和核酸檢測(cè)法。以上方法要么檢測(cè)周期久，要么操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高、檢陽(yáng)性假陰性率高，以上方法都面臨一個(gè)病原菌快速分離富集的問(wèn)題，現(xiàn)階段多采用過(guò)濾或梯度離心法，操作復(fù)雜效果差，嚴(yán)重制約了檢測(cè)產(chǎn)品的普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種大腸桿菌0157:H7核酸適體。本發(fā)明所述的大腸桿菌0157:H7核酸適體，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1:TTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG。本發(fā)明的核酶適體既包括原始的核苷酸序列，也包括對(duì)該原始核苷酸進(jìn)行修飾/改性得到的序列，修飾/改性的方法包括但不限于對(duì)核苷酸本身的化學(xué)修飾，化學(xué)修飾包括但不限于氨基、巰基、羧基或同位素等修飾；或在核苷酸序列的末端偶聯(lián)生物素、連接核苷酸序列、酶、發(fā)光基團(tuán)等。該核酸序列是通過(guò)SELEX技術(shù)(指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))篩選特異高效結(jié)合大腸桿菌0157:H7的核酸序列而得到的，該序列可用于樣本中大腸桿菌0157:H7的富集及檢測(cè)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種大腸桿菌0157:H7檢測(cè)試劑。本發(fā)明所述的大腸桿菌0157:H7檢測(cè)試劑，含有本發(fā)明所述的序列為SEQ ID NO:I的核酸適體。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于大腸桿菌0157:H7的分離富集方法。本發(fā)明所述的用于大腸桿菌0157:H7的分離富集方法，是采用本發(fā)明所述的核酸適體用于大腸桿菌0157:H7的分離富集方法，包括以下步驟:(I)將本發(fā)明所述的核酸適體的5’端偶聯(lián)在可分離載體上，得到分離富集載體；(2)將樣本與分離富集載體充分混合，富集得到大腸桿菌0157:H7和復(fù)合載體與所述的核酸適體的復(fù)合體；
(3)將復(fù)合載體上的大腸桿菌洗脫，得到從所述樣品中分離的大腸桿菌0157:H7。根據(jù)本發(fā)明所述的分離富集方法的進(jìn)一步特征，所述的如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列是通過(guò)連接序列偶聯(lián)在可分離載體上。根據(jù)本發(fā)明所述的分離富集方法的進(jìn)一步特征，所述步驟(I)中，所述的可分離載體為磁珠，將氨基化修飾的核酸適體與羧基磁珠在EDC催化下進(jìn)行偶聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明所述的分離富集方法的進(jìn)一步特征，所述步驟(I)中，所述的可分離載體為微球，將氨基化修飾的核酸適體與羧基微球在EDC催化下進(jìn)行偶聯(lián)。。根據(jù)本發(fā)明所述的分離富集方法的進(jìn)一步特征，連接序列為3 12個(gè)核苷酸序列。此核苷酸序列為不影響核酸適體二級(jí)結(jié)構(gòu)的隨意序列。該連接序列可避免核酸適體直接偶聯(lián)在載體上而導(dǎo)致核酶序列與目標(biāo)序列因?yàn)榇嬖诳臻g位阻而不能很好的結(jié)合。優(yōu)選地，可以在核酶適體的5’端連接若干個(gè)核苷酸作為連接序列。本發(fā)明所述的大腸桿菌0157:H7核酸適體，特異性好，親和力高，穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低、使用方便。該適體對(duì)樣本中的大腸桿菌0157:H7回收效率達(dá)到98%，與其它非特異結(jié)合的菌體交叉小于2% ;使用成本不到抗體的百分之一，且可反復(fù)變性復(fù)性穩(wěn)定性好。利用本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑，可以快速、有效、方便地檢測(cè)出大腸桿菌0157:H7。因此，本發(fā)明也提供一種可以快速、有效、方便地分離出大腸桿菌0157:H7的分離富集方法。


圖1是大腸桿菌0157: H7核酸適體偶聯(lián)磁珠及對(duì)靶標(biāo)菌體富集的一個(gè)實(shí)施例的示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。如圖1所示，氨基化修飾的核酸適體與羧基磁珠在EDC催化下偶聯(lián)，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)清洗后與含有大腸桿菌0157:H7的樣本混合，結(jié)合后再經(jīng)PBS兩次清洗，磁性富集得到大腸桿菌0157: H7和磁珠核酸適體的復(fù)合體，樣本中的大腸桿菌0157: H7的得到富集。實(shí)施例1:大腸桿菌0157:H7的分離富集。合成大腸桿菌0157:H7核酸適體，其核苷酸序列如下所示:5’ -TTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG-3’ (SEQ IDΝ0:1)ο該序列的5’端進(jìn)行氨基修飾。與磁珠偶聯(lián):取40 μ I羧基I μ m直徑的dynal beads磁珠，Iml的0.1M MES pH4.8溶液清洗兩次，定容于200 μ I的0.1M MES ρΗ4.8溶液，加入5 μ g已合成的核酸適體，和2mg的EDC室溫避光反應(yīng)4小時(shí)，加入2mg的BSA室溫放置30分鐘，用500 μ 10.02%吐溫20清洗一次，定容于500 μ I的I X TE中。將Ig點(diǎn)心樣本(康師傅蔬菜餅)加入5ml離心管，加入一定量的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品菌株(ATCC35150購(gòu)自ATCC)，用2mll XPBS重懸，加入100 μ I以上合成的核酸適體和磁珠，室溫放置20分鐘,每5分鐘顛倒混勻5次。將試管在磁場(chǎng)中富集2分鐘，小心去掉溶液，將磁珠用3mllXPBS重懸清洗兩次，得到大腸桿菌0157:H7與功能磁珠的復(fù)合體。
所得復(fù)合體定容于100 μ I無(wú)菌雙蒸水中，對(duì)照樣品為100 μ I無(wú)菌雙蒸水中加入與樣品中相同量的菌體，95°C加熱10分鐘，室溫12000rpm離心5分鐘，取5μ I上清用于實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。實(shí)施例2:大腸桿菌0157:Η7的分離富集。在實(shí)施例1合成的大腸桿菌0157:Η7核酸適體的基礎(chǔ)上，在5’端加入8個(gè)無(wú)關(guān)堿基的連接序列，例如以下序列:5，-ttttttttTTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG-3，(SEQ ID NO:2)。該連接序列可以有效減少磁珠的位阻效。同時(shí)，在5’端進(jìn)行氨基修飾。與磁珠偶聯(lián):取40 μ I羧基I μ m直徑的dynal beads磁珠，Iml的0.1M MES pH4.8溶液清洗兩次，定容于200 μ I的0.1M MES ρΗ4.8溶液，加入5 μ g已合成的核酸適體，和2mg的EDC室溫避光反應(yīng)4小時(shí)，加入2mg的BSA室溫放置30分鐘，用500 μ 10.02%吐溫20清洗一次，定容于500 μ I的I X TE中。將Ig點(diǎn)心樣本(康師傅蔬菜餅)加入5ml離心管，加入一定量的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品菌株(ATCC35150購(gòu)自ATCC)，用2mll XPBS重懸，加入100 μ I以上合成的核酸適體和磁珠，室溫放置20分鐘,每5分 鐘顛倒混勻5次。將試管在磁場(chǎng)中富集2分鐘，小心去掉溶液，將磁珠用3mllXPBS重懸清洗兩次，得到大腸桿菌0157:H7與功能磁珠的復(fù)合體。所得復(fù)合體定容于100 μ I無(wú)菌雙蒸水中，對(duì)照樣品為100 μ I無(wú)菌雙蒸水中加入與樣品中相同量的菌體，95°C加熱10分鐘，室溫12000rpm離心5分鐘，取5μ I上清用于實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。實(shí)施例3:大腸桿菌0157:Η7的分離富集。合成大腸桿菌0157:Η7核酸適體，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。tTTTACTATCCCCCCATATTTCCAAATTCCCGCCCTTTGGAAATATGAAAATAG-3’ 與微球偶聯(lián):3mg 的羧基微球加入200ul的0.1M的MES PH5.3溶液中，再添加5ug的5 ‘端修飾氨基的核酸適體，混勻后加入3mg的EDC，室溫反應(yīng)4小時(shí)候，加入2mg的BSA室溫放置30分鐘，離心3000rpm2分鐘，收集微球，用0.02%吐溫-20溶液清洗一次，PBS溶液清洗兩次，產(chǎn)物溶解于IOOul的IXTE溶液待用。將Ig點(diǎn)心樣本(康師傅蔬菜餅)加入5ml離心管，加入一定量的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品菌株(ATCC35150購(gòu)自ATCC)，用2mll XPBS重懸，加入100 μ I以上合成的核酸適體和磁珠，室溫放置20分鐘,每5分鐘顛倒混勻5次。將試管離心3000rpm2分鐘，小心去掉溶液，將磁珠用3mll XPBS重懸清洗兩次，得到大腸桿菌0157:H7與功能磁珠的復(fù)合體。實(shí)施例4:核酸適體的富集大腸桿菌0157:H7的效率和特異性。效率測(cè)試:用實(shí)施例2中的核酸適體-磁珠復(fù)合體產(chǎn)物IOOul，富集lml8000CFU/ml大腸桿菌0157:H7(購(gòu)自ATCC)，分別富集后的菌體-核酸適體-磁珠復(fù)合體和富集后的剩余菌體梯度稀釋涂板，確定菌體濃度。結(jié)果:富集產(chǎn)物稀釋至Iml的LB培養(yǎng)基中，0-100倍稀釋后，分別取50ul涂板。富集后剩余囷體直接50ul涂板。
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌0157:H7核酸適體，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種大腸桿菌0157:H7檢測(cè)試劑，其特征在于:所述試劑中含有如權(quán)利要求1所述的核酸適體。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸適體用于大腸桿菌0157:H7的分離富集方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將如權(quán)利要求1所述的核酸適體的5’端偶聯(lián)在可分離載體上，得到分離富集載體； (2)將樣本與分離富集載體充分混合，富集得到大腸桿菌0157:H7和復(fù)合載體與所述的核酸適體的復(fù)合體； (3)將復(fù)合載體上的大腸桿菌洗脫，得到從所述樣品中分離的大腸桿菌0157:H7。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離富集方法，其特征在于:所述的如權(quán)利要求1所述的核酸適體是通過(guò)連接序列偶聯(lián)在可分離載體上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的分離富集方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述的可分離載體為磁珠，將氨基化修飾的核酸適體與羧基磁珠在EDC催化下進(jìn)行偶聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的分離富集方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述的可分離載體為微球，將氨基化修飾的核酸適體與羧基微球在EDC催化下進(jìn)行偶聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離富集方法，其特征在于:連接序列為8個(gè)核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及大腸桿菌O157:H7核酸適體及其應(yīng)用方法。本發(fā)明提供了一種大腸桿菌O157:H7核酸適體，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明所述的大腸桿菌O157:H7核酸適體具有特異性好、親和力高、穩(wěn)定性好、開(kāi)發(fā)周期短、生產(chǎn)成本低、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種大腸桿菌O157:H7檢測(cè)試劑，含有本發(fā)明所述的核酸適體。本發(fā)明提供了一種用于大腸桿菌O157:H7的分離富集方法。本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑和分離富集方法，可以快速、有效、方便地分離出大腸桿菌O157:H7。
文檔編號(hào)C12N15/115GK103215272SQ201310149068
公開(kāi)日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月25日
發(fā)明者吳青, 張艷艷 申請(qǐng)人:廣州弗賽生物科技有限公司