0倍系列稀釋至1〇1°倍，取宿主菌培養(yǎng)液0. 2血分別加至 各平皿的底層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，吸取適當(dāng)稀釋度的瞻菌體懸液0.ImL分別加至各平皿與宿主菌混 合，倒入2~3血冷至50°C的上層瓊脂，混勻，凝固后37°C倒置培養(yǎng)18~2化，每一稀釋梯 度做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算瞻菌斑數(shù)。取瞻斑數(shù)在30~300個(gè)之間的平皿的平均值計(jì)算效價(jià)：
[0039] 效價(jià)（P化/mL)=平均瞻斑數(shù)X稀釋倍數(shù)X10
[0040] 4、瞻菌體的稀釋
[0041] 采用懸浮培養(yǎng)基（SM)對(duì)瞻菌體溶液進(jìn)行稀釋，并分裝于2mL細(xì)胞凍存管中保存。 [00創(chuàng)（S)均勻性測(cè)試
[0043] 取-80°C保存的樣品10管進(jìn)行瞻菌體效價(jià)測(cè)定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)樣品 的均勻性。
[0044] (四）穩(wěn)定性測(cè)試
[0045] 不同時(shí)間點(diǎn)分別取-20°C保存的樣品2管進(jìn)行瞻菌體效價(jià)測(cè)定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 評(píng)估穩(wěn)定性，取樣時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20個(gè)月。
[0046](五）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值
[0047] 根據(jù)均勻性測(cè)試的結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值，該大腸桿菌 瞻菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為1. 57Xl〇iip化/mL。
[0048] 實(shí)施例2 ;實(shí)時(shí)巧光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建
[0049] (1)樣品材料：將制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品（1. 57XIQiipfu/血）。ABIAmbionLife TechnologiesAM1005A評(píng)ath-IDOne-St巧RT-PCRKit。ABI7500FAST實(shí)時(shí)巧光定量 PCR儀。
[0050] (2)實(shí)時(shí)巧光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建
[CK)5U將制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品（1. 57Xl0iip化/mL)。10倍梯度稀釋至2. 5X109p化/mL，取 2. 5X109pfu/mL樣品200yL，在95°C條件下裂解5min，然后10倍梯度稀釋至10X、100X、 1000XU0000X，則分別對(duì)應(yīng)的瞻菌體MS2 濃度為 1. 57Xl08pfu/mL、l. 57Xl07pfu/mL、 1. 57Xl06pfu/mL、1. 57Xl05pfu/mL。
[0化2] 根據(jù)RT-PCR試劑盒的說明進(jìn)行RT-PCR預(yù)混液配制，每個(gè)反應(yīng)體系為25yL包 括預(yù)混液20yL和5yL的樣品，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，并在儀器上選擇和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)樣品 選項(xiàng)，根據(jù)瞻菌體MS2濃度賦值。RT-PCR反應(yīng)參數(shù)為；45°C，10min;95°C，10min;50個(gè)循 環(huán)；94°C，15sec;60°C，45sec。儀器根據(jù)賦值和Ct值自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3);y= 58. 716-3. 3521nx(y為Ct值，X為大腸桿菌瞻菌體MS2濃度（pfu/mL))。
[0053] 實(shí)施例3 ;WMS2為過程質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行諾沃克病毒的檢測(cè)
[0054] (1)樣品材料；從青島團(tuán)島市場(chǎng)購(gòu)買赤貝、巧孔扇貝、始蝴、牡頗各1份。
[0055] (2)用綴子、手術(shù)刀等打開貝類外殼，分離消化腺（digestiveglands),每種貝類 分別收集2g±0. 2到50mL離屯、管中，冰上操作，用無菌剪刀將內(nèi)臟團(tuán)剪碎。
[0056] (3)分別加2血的蛋白酶K工作液和100y1過程控制物質(zhì)（2. 5X108p化/血瞻菌 體MS2溶液），縱禍混勻。
[0057] (4)37°C搖床解育lh，320r/min。
[005引（5)60^水浴15111111。
[0059] (6) 4°C3000g離屯、5min，取上清液并記錄總體積，取500yL上清液提取RNA，最后 溶解于100yL的洗脫液中，W備PCR檢測(cè)。
[0060] (7)根據(jù)RT-PCR試劑盒的說明進(jìn)行RT-PCR預(yù)混液配制，每個(gè)反應(yīng)體系為25yL， 包括預(yù)混液20yL和5yL的樣品，每個(gè)樣品分別做原倍和10倍稀釋的RNA提取液，RT-PCR 反應(yīng)參數(shù)為；45°C，10min;95°C，10min;50 個(gè)循環(huán)；94°C，15sec;60°C，45sec。
[OOW] (8)根據(jù)RT-PCR的Ct值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出提取液中病毒的濃度，推斷出提取 效率。
[0062] (9)根據(jù)提取效率結(jié)果表明；提取效率在3. 70 % -7. 84 %之間，符合ISO 15216:2-2013的回收效率大于1%的要求。
[0063] 表1大腸桿菌瞻菌體MS2添加回收試驗(yàn)
[0064]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在于：濃度為I. 57X10 11Pfu/mL;該標(biāo) 準(zhǔn)樣品在食源性RNA病毒檢測(cè)過程中可被用作為檢測(cè)過程質(zhì)控物質(zhì)。
2. -種大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備，其特征在于，包括下列步驟： (一） 宿主菌的制備 先用接種環(huán)挑出一點(diǎn)ATCC15597大腸桿菌菌種接種在TSA-YE平板上過夜培養(yǎng)；挑取 1移菌環(huán)細(xì)菌至IOmLLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜； (二） 大量噬菌體MS2制備 1、 將(一）制備的宿主菌培養(yǎng)液按照0. 5% (體積比）接種到LB液體培養(yǎng)基中，36±1°C， 150rpm振蕩培養(yǎng)4-5h后，按0. 5-1% (體積比）的比例將噬菌體接種到上述細(xì)菌培養(yǎng)液中， 確保噬菌體個(gè)數(shù)與細(xì)菌個(gè)數(shù)之比在0. 1~2. 0 ; 2、 將接種后細(xì)菌培養(yǎng)液在36 ±1 °C，150rpm振蕩培養(yǎng)5h或過夜，取培養(yǎng)液在10 000 g下離心10min，收集上清液；用孔徑為0.22ym的膜過濾即得純化的噬菌體懸液； 3、 測(cè)定噬菌體的效價(jià) 采用雙層瓊脂法，具體操作如下： 將待測(cè)噬菌體懸液做10倍系列稀釋至101°倍，取宿主菌培養(yǎng)液0. 2mL分別加至各平皿 的底層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，吸取適當(dāng)稀釋度的噬菌體懸液0.ImL分別加至各平皿與宿主菌混合，倒 入2~3mL冷至50°C的上層瓊脂，混勻，凝固后37°C倒置培養(yǎng)18~24h，每一稀釋梯度 做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算噬菌斑數(shù)；取噬斑數(shù)在30~300個(gè)之間的平皿的平均值計(jì)算效價(jià)： 效價(jià)（pfu/mL) =平均噬斑數(shù)X稀釋倍數(shù)XlO 4、 噬菌體的稀釋 采用懸浮培養(yǎng)基（SM)對(duì)噬菌體溶液進(jìn)行稀釋，并分裝于2mL細(xì)胞凍存管中保存； (三） 穩(wěn)定性測(cè)試 不同時(shí)間點(diǎn)分別取25°C、4°C、_80°C保存的樣品3管進(jìn)行噬菌體效價(jià)測(cè)定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析各保存條件的穩(wěn)定性；25°C、4°C取樣時(shí)間持續(xù)6個(gè)月，每1個(gè)月取樣一次；-80°C取樣 時(shí)間持續(xù)24個(gè)月，每2個(gè)月取樣一次； (四） 均勻性測(cè)試 取-80°C保存的樣品15管進(jìn)行噬菌體效價(jià)測(cè)定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)樣品的均 勻性； (五） 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值 根據(jù)均勻性測(cè)試的結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值，該大腸桿菌噬菌 體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為1. 57XIO11pfu/mL。
3. -種大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品在食源性RNA病毒檢測(cè)過程中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品，濃度為1.57×1011pfu/mL；該標(biāo)準(zhǔn)樣品在食源性RNA病毒檢測(cè)過程中可被用作為檢測(cè)過程質(zhì)控物質(zhì)。本發(fā)明的大腸桿菌噬菌體MS2標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備，并進(jìn)行了均勻性和穩(wěn)定性性能測(cè)試，其保質(zhì)期為12個(gè)月。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68, C12N7-00
【公開號(hào)】CN104774974
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510227340
【發(fā)明人】房保海, 岳志芹, 張曉文, 王群, 鄭小龍, 王宮璞, 梁成珠, 徐彪
【申請(qǐng)人】山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年5月7日