包含源自細(xì)胞、細(xì)胞物質(zhì)或病毒物質(zhì)的一種或多種分子（例如多肽 或核酸）的溶液；或包含非-天然存在的核酸的溶液。樣品還可為包含細(xì)胞、細(xì)胞組分或核 酸的任何體液或排泄物（例如，但不限于，血液、尿液、糞便、唾液、眼淚、膽汁、腦脊液）。
[0033] 如本文所使用的短語"核酸"指能夠與互補(bǔ)核酸通過Watson-Crick堿基-配對(duì)雜 交的天然存在或合成的寡核苷酸或多核苷酸，無論DNA或RNA或DNA-RNA雜合物、單鏈或 雙鏈、有義或反義。本發(fā)明核酸還可包括核苷酸類似物（例如，BrdU)和非-磷酸二酯核苷 酸間連接（例如，肽核酸（PNA)或硫二酯連接）。特別地，核酸可包括，但不限于，DNA、RNA、 cDNA、gDNA、ssDNA、dsDNA或其任何組合。
[0034] "探針"、"引物"或"寡核苷酸"意指可與包含互補(bǔ)序列的第二個(gè)DNA或RNA分子 ("靶"）堿基-配對(duì)的定義序列的單鏈DNA或RNA分子。所得雜合物的穩(wěn)定性取決于長(zhǎng)度、 GC含量和發(fā)生堿基配對(duì)的程度。堿基-配對(duì)的程度受參數(shù)例如探針與靶分子之間的互補(bǔ)性 程度和雜交條件的嚴(yán)格性程度影響。雜交嚴(yán)格程度受參數(shù)例如溫度、鹽濃度和有機(jī)分子例 如甲酰胺的濃度影響，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的方法確定。探針、引物和寡核苷酸可通 過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法放射性、熒光或非-放射性地可檢測(cè)-標(biāo)記。dsDNA結(jié)合染 料可用于檢測(cè)dsDNA。應(yīng)理解的是"引物"特別地配置為通過聚合酶延伸，而"探針"或"寡 核苷酸"可以或可以不被如此配置。
[0035] "dsDNA結(jié)合染料"意指與單鏈DNA結(jié)合或在溶液中游離時(shí)相比，與雙鏈DNA結(jié)合 時(shí)所發(fā)出熒光不同的染料，通常發(fā)出熒光更強(qiáng)。當(dāng)提及dsDNA結(jié)合染料時(shí)，應(yīng)理解為本文中 可使用任何合適的染料，一些非-限制性的說明性的染料在美國(guó)專利號(hào)7, 387, 887中描述， 該專利通過引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域已知其它可用于檢測(cè)核酸擴(kuò)增和熔解的信號(hào)產(chǎn)生物 質(zhì)，例如酶、抗體等。
[0036] "特異性雜交"意指探針、引物或寡核苷酸在高度嚴(yán)格的條件下識(shí)別基本上互補(bǔ)的 核酸（例如，樣品核酸）并與之物理上相互作用（即，堿基-配對(duì)），并且基本上不與其它核 酸堿基配對(duì)。
[0037] "高度嚴(yán)格的條件"意指允許雜交與使用至少40個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA探針在包含0. 5 MNaHP04pH7.2、7%SDS、1mMEDTA和 1%BSA(FractionV)的緩沖液中于溫度 65°C下 或在包含 48% 甲酰胺、4.8XSSC、0.2MTris-ClpH7.6、1XDenhardt's溶液、10% 硫酸葡 聚糖和0.1%SDS的緩沖液中于溫度42°C下所獲的雜交相當(dāng)?shù)臈l件。其它用于高度嚴(yán)格雜 交例如用于PCR、Northern、Southern或原位雜交、DNA測(cè)序等的條件為分子生物學(xué)領(lǐng)域的 技術(shù)人員所熟知。
[0038] 當(dāng)PCR為本文實(shí)施例中所使用的擴(kuò)增方法時(shí)，應(yīng)理解為任何使用引物的擴(kuò)增方法 均可為合適的。此種合適的程序包括聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)、鏈置換擴(kuò)增（SDA)、基于核酸序 列的擴(kuò)增（NASBA)、級(jí)聯(lián)滾環(huán)擴(kuò)增（CRCA)、環(huán)介導(dǎo)的DNA等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)、等溫和嵌合引 物-起始的核酸擴(kuò)增（ICAN)、基于靶的解旋酶依賴性擴(kuò)增（HDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（TMA) 等。因此，當(dāng)使用術(shù)語PCR時(shí)，應(yīng)理解為包括其它可選的擴(kuò)增方法。對(duì)于無不連續(xù)循環(huán)的擴(kuò) 增方法，可使用在循環(huán)或Cp中進(jìn)行測(cè)量的反應(yīng)時(shí)間，并且在本文所述實(shí)施方案中加入額外 的PCR循環(huán)時(shí)可加入額外的反應(yīng)時(shí)間。應(yīng)理解的是方案可能需要相應(yīng)調(diào)整。
[0039] 新出現(xiàn)的技術(shù)，例如多重PCR或MALDI-T0F，能夠迅速檢測(cè)影響人類健康的許多細(xì) 菌和病毒病原體。通過同時(shí)篩查多種病原體，這些技術(shù)通過減少診斷所需的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)次 數(shù)節(jié)約了時(shí)間和金錢。迅速、廣譜而特異性的檢測(cè)的一個(gè)難題是并非所有的病原體以相同 的滴度存在。例如，在陽性血液培養(yǎng)物中革蘭氏陰性細(xì)菌通常生長(zhǎng)至較高的滴度，而酵母菌 生長(zhǎng)較緩慢，并且生長(zhǎng)至較低滴度。潛在的檢測(cè)背景環(huán)境生物使此問題進(jìn)一步復(fù)雜?？諝?、 土壤、灰塵和人類均為細(xì)菌生物攜帶者。此外，檢驗(yàn)試劑盒本身可包含痕量核酸，即使該檢 驗(yàn)試劑盒及其內(nèi)含物已經(jīng)滅菌。同樣，培養(yǎng)生物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基常常包含無活性生物，其不影 響培養(yǎng)，但可產(chǎn)生PCR假陽性。若將系統(tǒng)均勻地設(shè)計(jì)為增加靈敏度以檢測(cè)低滴度病原體，可 能會(huì)從背景生物中產(chǎn)生頻繁的假陽性?；蛘?，若降低系統(tǒng)靈敏度以避免檢測(cè)背景生物，可能 會(huì)錯(cuò)過低滴度生物，導(dǎo)致假陰性檢測(cè)。兩步多重PCR方案使得能夠檢測(cè)寬范圍的滴度，但此 寬范圍檢測(cè)可能使其難以區(qū)分真陽性和少數(shù)環(huán)境污染物。通過逐一調(diào)整每個(gè)測(cè)定檢測(cè)前進(jìn) 行的PCR循環(huán)數(shù)目，在與較高滴度靶生物相同的多重PCR反應(yīng)中可容易地檢測(cè)低滴度靶標(biāo)， 同時(shí)使來自背景污染物、交叉_反應(yīng)性（在高度多重反應(yīng)中可能成為問題）和其它無關(guān)擴(kuò) 增的假陽性判定最小化。
[0040] 本文所公開的各個(gè)實(shí)施方案使用自含的核酸分析袋說明性地在單一的封閉系統(tǒng) 中測(cè)定樣品中各種生物物質(zhì)（說明性地，抗原和核酸序列）的存在情況。這樣的系統(tǒng)，包括 袋和與袋一起使用的儀器，在美國(guó)專利號(hào)8, 394, 608、美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0056383和TO 2013/074391中更詳細(xì)地公開，所述專利通過引用結(jié)合到本文中。然而，應(yīng)理解的是這樣的 袋僅為說明性的，本文所討論的多重PCR反應(yīng)可在本領(lǐng)域已知的多種開放或封閉系統(tǒng)樣品 容器，包括96-孔板、其它配置的板、陣列、圓盤傳送帶等的任一中使用本領(lǐng)域所知的多種 擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行。當(dāng)本文中使用術(shù)語"樣品孔"時(shí)，該術(shù)語意指包括孔、管和各種其它反應(yīng)容 器，如在這些擴(kuò)增系統(tǒng)中所使用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，袋用于測(cè)定多種病原體。用作說明 地，各個(gè)步驟可在任選一次性的袋中進(jìn)行，包括核酸制備、初級(jí)大體積多重PCR、初級(jí)擴(kuò)增產(chǎn) 物的稀釋和次級(jí)PCR，最后為任選的實(shí)時(shí)檢測(cè)或擴(kuò)增后分析例如熔解曲線分析。此外，應(yīng)理 解的是盡管各個(gè)步驟可在本發(fā)明袋中進(jìn)行，但對(duì)于某些用途可省略一個(gè)或多個(gè)步驟，并且 袋的配置可相應(yīng)改變。
[0041] 圖1顯示當(dāng)前發(fā)明使用的說明性的袋510。袋510與美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0056383 (已經(jīng)通過引用結(jié)合）的圖15相似，相似的項(xiàng)目編號(hào)相同。配件590擁有入口通道515a至 5151，其還用作試劑槽。說明性地，試劑可在配件590中冷凍干燥并在使用前再水化。泡 (Blister) 522、544、546、548、564 和 566,以及其各自的通道 538、543、552、553、562 和 565， 與美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0056383的圖15的相同編號(hào)的泡相似。圖1的第二階段反應(yīng)區(qū)580 與美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0056383相似，但高密度陣列581的第二階段孔582以稍微不同的 模式排列。圖1的高密度陣列581的更圓的模式消除了轉(zhuǎn)角，可導(dǎo)致第二階段孔582更均 勻填充。如圖所示，高密度陣列581擁有102個(gè)第二階段孔582。袋510適合在FilmArray 儀器中使用。然而，應(yīng)理解的是該袋的實(shí)施方案僅為說明性的。
[0042] 袋510可以以與美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0056383中所述相似的方式使用。將包含 待檢驗(yàn)樣品（100y1)和裂解緩沖液（200y1)的300y1混合物注入配件590中入口通 道515a附近的注射口（未示出），樣品混合物被吸入入口通道515a中。同樣將水注入配 件590臨近入口通道5151的第二個(gè)注射口（未示出），經(jīng)由配件590中提供的通道（未示 出）分布，從而使十一種不同的試劑吸水，其中每種試劑預(yù)先以干燥形式在入口通道515b 至5151處提供。這些試劑說明性地可包括冷凍干燥的PCR試劑、DNA提取試劑、洗滌溶液、 免疫測(cè)定試劑或其它化學(xué)實(shí)體。說明性地，試劑用于核酸提取、第一階段多重PCR、多重反應(yīng) 的稀釋和第二階段PCR試劑的制備，以及對(duì)照反應(yīng)。在圖1所示的實(shí)施方案中，所有需要被 注入的為一個(gè)注射口的樣品溶液和另一個(gè)注射口的水。注入后，可將兩個(gè)注射口密封。關(guān) 于袋510和配件590不同配置的更多信息，參見美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010-0056383,該專利已經(jīng) 通過引用結(jié)合。
[0043] 注入后，樣品從注射通道515a經(jīng)由通道514移動(dòng)至裂解泡522。裂解泡522擁有陶 瓷珠，并且配置為使用FilmArray儀器內(nèi)提供的回轉(zhuǎn)葉片或槳經(jīng)由撞擊來渦旋。一旦細(xì)胞 被充分裂解，樣品通過通道538、泡544和通道543移動(dòng)至泡546,樣品在該處與核酸-結(jié)合 的磁珠混合。讓混合物孵育適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，說明性地，約10秒至10分鐘。位于FilmArray 儀器內(nèi)臨近泡546的可縮回磁體從溶液中捕獲磁珠，在泡546內(nèi)部表面形成沉淀。然后將 液體移出泡546,通過泡544回到泡522,該泡現(xiàn)在用作廢物容器。注射通道515c-515e的 一個(gè)或多個(gè)的一種或多種洗滌緩沖液經(jīng)由泡544和通道543提供至泡546。任選地，縮回 磁體，通過從泡544和546經(jīng)由通道543來回移動(dòng)小珠洗滌磁珠。磁珠一經(jīng)洗滌后，通過激 活磁體將其重新捕獲入泡546,然后將洗滌溶液移至泡522。該過程可按