金黃色葡萄球菌為中度污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，盡管根據(jù)圖4A-B中所示數(shù)據(jù)選擇循環(huán)32為 可接受的，循環(huán)26也是一個(gè)可行的選擇，其具有較低的來自環(huán)境污染的假陽性風(fēng)險(xiǎn)。
[0058] 對(duì)說明性BCID板中的每種生物均進(jìn)行分析以確定熔解循環(huán)1 (第二階段PCR循 環(huán)20)、熔解循環(huán)2 (第二階段PCR循環(huán)26)或熔解循環(huán)3 (第二階段PCR循環(huán)32)是否將 最適合用于最小化假陽性和假陰性二者。生物如下表1分配： 表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定樣品中含有多種生物中的哪些的方法，包括 提供多個(gè)樣品孔，每個(gè)樣品孔含有部分樣品和用于擴(kuò)增來自多種生物中的不同生物的 靶核酸序列的引物， 同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件，經(jīng)歷若干擴(kuò)增循環(huán)， 檢測(cè)第一組多個(gè)樣品孔的每個(gè)中是否發(fā)生擴(kuò)增， 同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件，經(jīng)歷若干額外的擴(kuò)增循環(huán)， 檢測(cè)第二組多個(gè)樣品孔的每個(gè)中是否發(fā)生擴(kuò)增， 通過鑒定至少一個(gè)發(fā)生擴(kuò)增的對(duì)應(yīng)樣品孔鑒定樣品中存在的至少一種生物。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中第一個(gè)檢測(cè)步驟不涉及檢測(cè)第二組多個(gè)樣品孔中是否發(fā)生 擴(kuò)增，第二個(gè)檢測(cè)步驟不涉及檢測(cè)第一組多個(gè)樣品孔中是否發(fā)生擴(kuò)增。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中第一組第一個(gè)樣品孔的陽性或陰性判定決定第二個(gè)樣品孔 是在第一組還是在第^組中。
4. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括 同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件，經(jīng)歷另一個(gè)若干額外擴(kuò)增循環(huán)， 檢測(cè)第三組多個(gè)樣品孔的每個(gè)中是否發(fā)生擴(kuò)增。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目為20個(gè)PCR循環(huán)，額外擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目為 6個(gè)額外的PCR循環(huán)，另一個(gè)額外擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目為6個(gè)額外的PCR循環(huán)。
6. 權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括至少一個(gè)額外的同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng) 歷又一個(gè)若干額外擴(kuò)增循環(huán)的步驟和至少一個(gè)額外的檢測(cè)步驟。
7. 權(quán)利要求4的方法，其中第一組多個(gè)樣品孔配置為擴(kuò)增來自以最高滴度存在的生物 的靶核酸序列并具有最高的不期望陽性的風(fēng)險(xiǎn)，第二組多個(gè)樣品孔配置為擴(kuò)增來自以高滴 度存在的生物的靶核酸序列并具有中等的不期望陽性的風(fēng)險(xiǎn)，第三組多個(gè)樣品孔配置為擴(kuò) 增來自以低滴度存在的生物的靶核酸序列并具有低的不期望陽性的風(fēng)險(xiǎn)。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括使多個(gè)樣品孔經(jīng)受熔解條件和檢測(cè)靶核 酸序列是否發(fā)生熔解。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中檢測(cè)是否發(fā)生熔解包括檢測(cè)多個(gè)樣品孔的每個(gè)在預(yù)定溫度 范圍內(nèi)的熔解峰。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)步驟包括分析每個(gè)樣品孔的擴(kuò)增曲線。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中分析擴(kuò)增曲線包括測(cè)定交叉點(diǎn)。
12. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在提供步驟前使樣品經(jīng)受多重?cái)U(kuò)增。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所有步驟在單獨(dú)的封閉系統(tǒng)中進(jìn)行。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中所有檢測(cè)步驟包括檢測(cè)多個(gè)樣品孔的任一中是否發(fā)生擴(kuò) 增。
15. 權(quán)利要求1的方法，其中第一個(gè)檢測(cè)步驟中的陽性判定指示染色體整合，第一個(gè)檢 測(cè)步驟中的陰性判定并且第二個(gè)檢測(cè)步驟中的陽性判定指示臨床-相關(guān)感染。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中每個(gè)樣品孔進(jìn)一步包含熒光染料，第一個(gè)檢測(cè)步驟采用第 一個(gè)水平的照明，第二個(gè)檢測(cè)步驟采用第二個(gè)水平的照明。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中第二個(gè)水平比第一個(gè)水平高，并且進(jìn)一步包括步驟： 同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件，經(jīng)歷額外若干個(gè)額外擴(kuò)增循環(huán)， 通過采用第三個(gè)水平的照明檢測(cè)第二組多個(gè)樣品孔的每個(gè)中是否發(fā)生擴(kuò)增，第三個(gè)水 平比第二個(gè)水平高。
18. 用于鑒定樣品中含有多個(gè)靶核酸中的哪些的方法，包括 提供多個(gè)樣品孔，每個(gè)樣品孔具有用于擴(kuò)增來自多個(gè)靶核酸序列中不同序列的基因座 的引物， 將一部分樣品移至多個(gè)樣品孔的每個(gè)中， 同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷若干擴(kuò)增循環(huán)， 檢測(cè)第一組多個(gè)樣品孔的每個(gè)中是否發(fā)生擴(kuò)增， 同時(shí)使多個(gè)樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件，經(jīng)歷若干額外的擴(kuò)增循環(huán)， 檢測(cè)第二組多個(gè)樣品孔的每個(gè)中是否發(fā)生擴(kuò)增， 通過鑒定發(fā)生擴(kuò)增的對(duì)應(yīng)樣品孔鑒定樣品中存在的靶核酸。
19. 權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括 在單個(gè)多重?cái)U(kuò)增反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增所有基因座，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)移步驟。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中檢測(cè)步驟包括檢測(cè)指示擴(kuò)增的熒光的變化。
21. 權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括在額外的擴(kuò)增循環(huán)前增加光源功率的步驟。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中額外擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目為一個(gè)循環(huán)。
23. 用于檢測(cè)樣品中存在多個(gè)靶核酸中的哪些的系統(tǒng)，包括 包含多個(gè)樣品孔的容器，每個(gè)樣品孔配置為持有一部分樣品、對(duì)靶核酸之一具有特異 性的核酸引物、信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)和用于擴(kuò)增的組分， 配置為容納上述容器并使該容器經(jīng)受擴(kuò)增條件的儀器，該儀器進(jìn)一步包括用于檢測(cè)擴(kuò) 增發(fā)生時(shí)來自信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)的信號(hào)的檢測(cè)器， 其中所述儀器程序設(shè)計(jì)為固定量的擴(kuò)增后輸出第一組多個(gè)樣品孔中每個(gè)的結(jié)果，額外 的固定量擴(kuò)增后輸出第二組多個(gè)樣品孔中每個(gè)的結(jié)果。
24. 權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中所述擴(kuò)增為PCR，所述組分包括聚合酶和dNTP。
25. 權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中固定量的擴(kuò)增為特定數(shù)目的循環(huán)，額外的固定量的擴(kuò)增 為額外的特定數(shù)目的循環(huán)。
26. 權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中所述信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)為熒光染料。
27. 權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中光源功率增加。
28. 權(quán)利要求23的系統(tǒng)，其中結(jié)果基于預(yù)定溫度范圍內(nèi)的熔解峰的存在或不存在情 況，其中熔解峰存在輸出陽性結(jié)果，熔解峰不存在輸出陰性結(jié)果。
29. 用于區(qū)分樣品中染色體整合和臨床-相關(guān)感染的方法，包括 提供其中包含樣品和用于擴(kuò)增來自樣品的靶核酸序列的引物的樣品孔， 使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷若干擴(kuò)增循環(huán)， 檢測(cè)樣品孔中是否發(fā)生擴(kuò)增， 使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷若干額外擴(kuò)增循環(huán)，和 檢測(cè)樣品孔中是否發(fā)生擴(kuò)增。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中第一個(gè)檢測(cè)步驟中的陽性判定指示染色體整合，第一個(gè) 檢測(cè)步驟中的陰性判定與第二個(gè)檢測(cè)步驟中的陽性判定指示臨床-相關(guān)感染。
31. 用于分析樣品中靶核酸的方法，包括 (a) 提供其中包含樣品和用于擴(kuò)增靶核酸的引物的樣品孔， (b) 使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)， (c) 產(chǎn)生所擴(kuò)增靶核酸的熔解曲線，和 (d) 重復(fù)步驟（b)和（c)。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中步驟（c)進(jìn)一步包括測(cè)定恪解曲線的值，并進(jìn)一步包括步 驟 (e) 通過鑒定其中熔解曲線的值超過預(yù)定值的擴(kuò)增循環(huán)測(cè)定Cp。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中所述值通過熔解曲線負(fù)導(dǎo)數(shù)的峰高或峰面積測(cè)定。
34. 用于分析樣品中靶核酸的方法，包括 (a) 提供其中包含樣品、用于擴(kuò)增靶核酸的引物、對(duì)照核酸、用于擴(kuò)增對(duì)照核酸的引物 和dsDNA結(jié)合染料的樣品孔， (b) 使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷至少一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)， (c) 產(chǎn)生所擴(kuò)增靶核酸和所擴(kuò)增對(duì)照核酸的熔解曲線， (d) 測(cè)定所擴(kuò)增靶核酸的值，和 (e) 重復(fù)步驟（b)、（c)和（d)。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中步驟（d)還包括測(cè)定所擴(kuò)增對(duì)照核酸的值。
36. 權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包括使用步驟（d)中測(cè)定的值產(chǎn)生靶核酸的校正擴(kuò)增 曲線的步驟。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述熔解曲線繪制為負(fù)導(dǎo)數(shù)熔解曲線，所述值通過靶核 酸和對(duì)照核酸的每個(gè)在所選溫度窗口中的峰高和峰面積測(cè)定。
38. 權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定靶核酸相對(duì)于對(duì)照核酸初始濃度的相對(duì)初始 濃度的步驟。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中相對(duì)起始濃度使用下式測(cè)定 ET*Cp,t/EC*Cp，c 其中 ET和EC為靶和對(duì)照效率，和 Cp，t和Cp，c為靶和對(duì)照交叉點(diǎn)，通過所擴(kuò)增模板核酸的值超過預(yù)定值的循環(huán)和所擴(kuò) 增對(duì)照核酸超過預(yù)定值的循環(huán)測(cè)定。
40. 權(quán)利要求35的方法，進(jìn)一步包括產(chǎn)生對(duì)照核酸的校正擴(kuò)增曲線的步驟。
【專利摘要】提供了用于將多個(gè)樣品孔同時(shí)擴(kuò)增預(yù)定量的擴(kuò)增、檢測(cè)第一組孔中是否發(fā)生擴(kuò)增、擴(kuò)增額外量的擴(kuò)增和檢測(cè)第二組孔中是否發(fā)生擴(kuò)增的方法和裝置。還提供了用于使用多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中所產(chǎn)生的熔解曲線分析靶核酸序列的方法。
【IPC分類】C40B40-00, C40B30-04
【公開號(hào)】CN104781459
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380046847
【發(fā)明人】P. 拉斯穆森 R., J. 克里斯普 R., C. 赫默特 A., D. B. 坎貝爾 E., C. 羅賓斯 T., J. 艾爾 D.
【申請(qǐng)人】拜奧法爾診斷有限責(zé)任公司
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2013年9月9日
【公告號(hào)】CA2880583A1, EP2893062A1, US20150232916, WO2014039963A1