一種制備活性短肽的大腸桿菌菌株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種制備活性短肽的大腸桿菌菌株。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌是存在于恒溫動(dòng)物腸道中的一種革蘭氏陰性圓形桿菌。大多數(shù)的大腸桿 菌的菌株是沒有危害的，但是一些血清型可以導(dǎo)致人類嚴(yán)重的食物中毒。沒有危害的大腸 桿菌是腸道的正常菌群的一部分，其產(chǎn)生維生素K2對(duì)宿主是有益的，而且還能防止腸道中 其他致病性病源菌的生成。大腸桿菌占整個(gè)腸道菌群的〇. 1%，糞口傳播途徑是該病原菌 致病的重要途徑。同時(shí)大腸桿菌是被廣泛研宄的原核模式生物，因其可作為重組DNA的宿 主，是微生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)重要的細(xì)菌。正因?yàn)榇竽c桿菌具有如此重要的作用， 通過表型研宄空間環(huán)境下的細(xì)菌突變株，并利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組三大組學(xué)研宄方 法，研宄細(xì)菌對(duì)空間環(huán)境的適應(yīng)性變化，關(guān)注其致病性、耐藥性的變化，為預(yù)防感染性疾病 在空間站中的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。
[0003] 目前已有大量"通過常規(guī)分離手段純化高純活性肽"的專利報(bào)道，盡管研宄者們鑒 定出的某些肽段顯示出極強(qiáng)的生理活性，如IPP、VPP、IKW、LHP等降血壓肽和YHY、PHH、YKY、 YPPAK、HDHPVC等抗氧化肽，但由于蘊(yùn)藏于母體蛋白序列中的有效活性肽段比例低，導(dǎo)致酶 解后期的低產(chǎn)率和高分離成本，除了極少數(shù)活性肽段，如IPP、VPP等有產(chǎn)品問世外，大多數(shù) 高活性功能肽并沒有得到有效開發(fā)利用。
[0004] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用DNA重組技術(shù)，將表達(dá)活性肽的基因克隆到某些 微生物或動(dòng)物體內(nèi)，通過生物體直接表達(dá)出所需肽類，可大大增加其產(chǎn)量和純度。目前，有 關(guān)"利用基因工程菌制備活性肽"的專利報(bào)道已呈逐年增多的趨勢(shì)。盡管利用基因工程技 術(shù)制備高活性短肽已取得了技術(shù)上的突破，但活性肽多聚體的基因設(shè)計(jì)、表達(dá)效率及下游 分離工藝有待進(jìn)一步的完善。
[0005] 近年來，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研宄表明人體內(nèi)除了具有升壓物質(zhì)及系統(tǒng) 外，尚具有許多內(nèi)源性減壓物質(zhì)及系統(tǒng)，以維持血壓的相對(duì)穩(wěn)定。如果將降血壓肽和抗氧化 肽聯(lián)合應(yīng)用于心血管疾病的預(yù)防與控制，將會(huì)起到良好的效果。已有不少研宄報(bào)道了通過 酶解法同步制備高降血壓肽與抗氧化聯(lián)合作用的相關(guān)報(bào)道。但是，目前尚無利用基因工程 菌同步制備ACE抑制肽和抗氧化肽的報(bào)道。
[0006] 目前，缺乏一種體內(nèi)活性高、成本低的制備活性短肽的大腸桿菌菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種體內(nèi)活性高、成本低的制備活性短肽的大腸桿菌菌株。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種制備活性短肽的大腸桿菌菌株，該菌 株為大腸桿菌；保藏名稱為大腸埃希氏菌Escherichia coli ;保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；保藏 日期：2014年10月24日；保藏編號(hào)：CGMCC No. 9842。
[0009] 本發(fā)明所述的大腸桿菌制備的大腸桿菌菌劑。
[0010] 本發(fā)明所述的大腸桿菌菌劑，其活性成分為如下（a) (b) (c)中的至少一種：
[0011] (a)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物；
[0012] (b)權(quán)利要求1所得大腸桿菌細(xì)胞的超聲裂解上清；
[0013] (c)權(quán)利要求1所得大腸桿菌細(xì)胞的超聲裂解沉淀。
[0014] 本發(fā)明制備所述大腸桿菌菌劑的方法，包括如下步驟：
[0015] (1)將菌株單菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培養(yǎng)基中，溫度為37°C，攪拌 速率為200rpm搖床培養(yǎng)12-14h，
[0016] (2)將培養(yǎng)液按2 %的接種量轉(zhuǎn)接入含50 y g/ml的Kana的TB培養(yǎng)液中，溫度為 37°C，攪拌速率為200rpm，
[0017] (3)搖瓶將大腸桿菌菌種培養(yǎng)至菌體OD值達(dá)到0. 6-0. 8,添加IPTG至終濃度為 0. 02-0. 2mM，溫度為20-37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為5-20h后，取樣SDS-PAGE分析，制得大腸桿菌 菌劑。
[0018] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，所述LB培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比由1 % Tryptone、0. 5% Yeast extract、1 % NaCl、pH 7. 0 的組分組成。
[0019] 進(jìn)一步地，在步驟（2)中，所述TB培養(yǎng)液按質(zhì)量百分比由1.2% Tryptone、2.4% Yeast extract、。. 4% glycerol、0. 2% 腿2卩04和 1. 6% K2HP04的組分組成。
[0020] 本發(fā)明所述的大腸桿菌菌株在制備治療高血壓藥中的應(yīng)用。
[0021] 有益效果：本發(fā)明的菌株體內(nèi)活性高、成本低的特點(diǎn)。大腸桿菌菌劑屬于生物制 劑，完全沒有因化學(xué)藥劑的使用所帶來的化學(xué)抗藥性等問題。獲得的重組多肽中的活性小 肽能被胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶有效釋放，制得的活性肽混合體具有高體內(nèi)降 壓活性及抗氧化活性。本發(fā)明終產(chǎn)品小肽混合物協(xié)同降壓的同時(shí)能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功 能，多角度預(yù)防與維護(hù)心血管健康；本發(fā)明菌株在制備治療高血壓藥中具有廣闊的應(yīng)用前 景。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明所構(gòu)建重組質(zhì)粒示意圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明的重組質(zhì)粒PCR鑒定示意圖；
[0024] 圖3為本發(fā)明的重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定示意圖；
[0025] 圖4為SDS-PAGE鑒定重組蛋白包涵體表達(dá)示意圖；
[0026] 圖5為SDS-PAGE鑒定重組蛋白純化示意圖；
[0027] 圖6為SDS-PAGE鑒定重組多肽A3純化示意圖；
[0028] 圖7為SDS-PAGE鑒定重組蛋白可溶性表達(dá)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面將通過附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的具體描述，但不能理解為是對(duì) 本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 本發(fā)明提供了一種菌株，一種制備活性短肽的大腸桿菌菌株，該菌株為大腸桿 菌；保藏名稱為大腸埃希氏菌；保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；保藏日期：2014年10月24日；保 藏編號(hào)：CGMCC No. 9842。
[0032] 本發(fā)明所述的大腸桿菌制備的大腸桿菌菌劑。
[0033] 本發(fā)明所述的大腸桿菌菌劑，其活性成分為如下（a) (b) (c)中的至少一種：
[0034] (a)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物；
[0035] (b)權(quán)利要求1所得大腸桿菌細(xì)胞的超聲裂解上清；
[0036] (c)權(quán)利要求1所得大腸桿菌細(xì)胞的超聲裂解沉淀。
[0037] 本發(fā)明制備所述大腸桿菌菌劑的方法，包括如下步驟：
[0038] (1)將菌株單菌落于20ml含50 y g/ml的Kana的LB培養(yǎng)基中，溫度為37°C，攪拌 速率為 200rpm 搖床培養(yǎng) 12h，所述 LB 培養(yǎng)基為 1 % Tryptone、0. 5 % Yeast extract、1 % 似01、口117.0。所述1^培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比由1%1^5^1：〇116、0.5%￥638七611：四(31：、1% NaCl、pH 7. 0的組分組成。
[0039] (2)將培養(yǎng)液按2 %的接種量轉(zhuǎn)接入含50 y g/ml的Kana的TB培養(yǎng)液中，溫度為 37