一種腸桿菌屬菌株CV-v及其降解孔雀石綠的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于污水中染料降解技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及一種腸桿菌屬菌株CV-V及 其降解孔雀石綠的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孔雀石綠（MalachiteGreen,MG)，是一種極易溶于水的三苯甲燒類染料，可廣泛 應(yīng)用于印染、食品加工、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖和工業(yè)等各個領(lǐng)域中，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，孔雀石 綠可作為驅(qū)蟲劑、殺蟲劑、防腐劑廣泛用于預(yù)防與治療水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等。但 其廣泛使用造成的負(fù)面效應(yīng)，如對哺乳動物細(xì)胞、水生生物和其他有機(jī)生命體的致癌致 畸效應(yīng)，也凸現(xiàn)出來，引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。因此，美國、日本、英國等許多國家和地 區(qū)，立法嚴(yán)禁使用孔雀石綠，且該染料已被美國食品和藥物管理局（USFoodandDrug Administration)列為致癌性測試的優(yōu)先化學(xué)物質(zhì)之一，也被我國列入《食品動物禁用的獸 藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動物?？兹甘G在水生生物體中的主要代謝產(chǎn)物 為隱性孔雀石綠（leucomalachitegreen，LMG)，其殘留毒性比孔雀石綠更強(qiáng)，對人們的健 康構(gòu)成了潛在的巨大威脅。
[0003] 由于孔雀石綠本身或其降解產(chǎn)物的生物毒性較大，盡管許多科學(xué)工作者已致力于 解決由孔雀石綠造成的環(huán)境污染問題，例如應(yīng)用吸附、化學(xué)沉淀、光降解、滲透和膜過濾等 理化處理技術(shù)處理污染水源；然而，由于這些處理方法不僅處理費用高、效率低，而且在治 污的同時容易產(chǎn)生二次污染和難以處置的底泥，因此，極大地限制了其廣泛推廣使用。生物 處理技術(shù)作為一種環(huán)境友好型且高效低耗的處理手段而受到越來越廣泛的關(guān)注。其中，細(xì) 菌由于生長速度快，容易獲得大量生物量，且易產(chǎn)生大量降解相關(guān)酶，對染料的降解效率也 較高等優(yōu)勢而受到環(huán)境工作者的青睞。
[0004] 以往的研宄顯示，很多微生物被從環(huán)境中分離出來，測試其對孔雀石綠的降解行 為，這些微生物包括Chlorellasp.、Shewanellasp?和Pseudomonassp?等。已分離的菌 株對孔雀石綠的降解行為各異，但總體而言，降解效率仍差強(qiáng)人意，因此，仍有必要廣泛篩 選孔雀石綠高效降解菌株，并研宄其降解行為等。同時，環(huán)境溫度等因素對細(xì)菌降解孔雀石 綠的降解效果影響較大。然而，環(huán)境溫度往往隨季節(jié)變化顯著，以浙江省為例，全省全年最 低氣溫可達(dá)零下3度以下，最高可達(dá)40度以上，加之實際含染料廢水或過酸或過堿，這些因 素極大地限制了實驗室篩選出的高效降解菌株在實踐中的應(yīng)用。要解決這一問題，就必須 加強(qiáng)篩選環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)或能更好的適應(yīng)本地環(huán)境的高效降解菌株的研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種腸桿菌屬菌株CV-V，該菌 株能高效降解污水中的孔雀石綠。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種腸桿菌屬菌株CV-V降解孔雀石綠的方法，能最 大化的發(fā)揮出菌株CV-V降解孔雀石綠的作用。
[0007] 本發(fā)明目的之一通過提供一種腸桿菌屬（Enterobatersp.)菌株CV-v來實現(xiàn)，其 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為CCTCCN0:M2015177。
[0008] 本發(fā)明目的之二是這樣實現(xiàn)的一種腸桿菌屬菌株CV-v降解孔雀石綠的方法，其 關(guān)鍵在于由以下步驟組成：a、培養(yǎng)菌株：將菌株CV-v接種于LB培養(yǎng)基中，在30°C條件下， 于轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中培養(yǎng)12-18h，以獲得大量菌體；b、將經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體培養(yǎng) 物，將干重為0.1-0. 2g/L的菌體接種于孔雀石綠染料濃度為1000mg/L或以下的污染水體 中，并震蕩培養(yǎng)6h以上，脫色pH范圍為3. 0-10. 0,溫度范圍為10-50°C。
[0009] 優(yōu)選地，上述步驟b中孔雀石綠染料濃度為600mg/L以下，震蕩培養(yǎng)時間為6h。
[0010] 優(yōu)選地，上述步驟b中孔雀石綠染料濃度為500mg/L以下。
[0011] 優(yōu)選地，上述步驟b中溫度范圍為20~50°C。
[0012] 優(yōu)選地，上述步驟b中震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0013] 優(yōu)選地，上述步驟a中LB培養(yǎng)基由蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L配制 而成。
[0014] 一、腸桿菌屬（Enterobatersp.)菌株CV-v
[0015] 一種腸桿菌屬（Enterobatersp.)菌株CV_v，于2015年3月29日在中國典型培 養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏編號為CCTCCN0:M2015177。
[0016] 腸桿菌屬（Enterobatersp.)菌株CV-v革蘭氏染色結(jié)果顯不該菌株是革蘭氏陰 性菌，短桿狀，如圖1所示。以菌株CV-v基因組為模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，檢測PCR產(chǎn)物、回收、純化后測序，獲得1447nt的CV-v菌株的16SrRNA基因 片段，在GenBank中的登錄序號為KF956722,序列如序列表所示。該序列經(jīng)與GenBank中的 數(shù)據(jù)比對后發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中該菌株與腸桿菌屬（Enterobactersp.)聚類在一起，表 明菌株CV-v屬于腸桿菌。
[0017] 二、材料和方法：
[0018] 1、培養(yǎng)基與試劑：
[0019] 孔雀石綠（MalachiteGreen，Xmax= 620nm)屬于三苯甲燒類染料，購自國藥集團(tuán) 化學(xué)試劑有限公司。其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0020] 碳源影響實驗培養(yǎng)基母液（pH7. 0,g/L) :Na2HP04,15. 13 ;KH2P04,3. 0 ;NaCl，0. 5 ; NH4C1，1. 0 ;MgS04 ? 7H20,0. 491 ;CaCl2 ? 2H20,0. 026。
[0021]氮源影響實驗培養(yǎng)基母液（pH7. 0,g/L) :Na2HP04,15. 13 ;KH2P04,3.0;NaCl，0. 5 ; MgS04 ? 7H20,0. 491 ;CaCl2 ? 2H20,0. 026。
[0022] 其他因子影響實驗培養(yǎng)基母液（pH7. 0)為2. Og/L的酵母粉溶液。
[0023] 1^培養(yǎng)基&117.0~7.2,8/1):蛋白胨，10;酵母粉，5;似(：1，10。
[0024] 2、菌株CV-v對孔雀石綠的脫色特性研宄
[0025] 2. 1碳、氮源對孔雀石綠脫色的影響
[0026] 將供試碳、氮源（葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、木糖和淀粉；氯化銨、 硝酸鈉、牛肉浸提物、酵母粉、蛋白胨、谷氨酸和甘氨酸）分別添加至培養(yǎng)基中，使其終濃度 為2. 0g/L。滅菌后，添加已滅菌的終濃度為100mg/L的孔雀石綠，接種等量菌株CV-v過夜 培養(yǎng)物（菌體干重為〇. 1-0. 2g/L)，并于30°C、180rpm條件下震蕩培養(yǎng)，定時取樣測定。
[0027]2. 2pH值對孔雀石綠脫色的影響
[0028]用 1.Omol/L的HC1 或NaOH將培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)為 2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、 7. 0、8. 0、9. 0和10. 0。滅菌后，添加已滅菌的終濃度為lOOmg/L的孔雀石綠，接種等量菌株 CV-v過夜培養(yǎng)物（菌體干重為0.lg/L)，并于30°C、180rpm條件下震蕩培養(yǎng)，定時取樣測 定。
[0029] 2. 3溫度對孔雀石綠脫色的影響
[0030] 設(shè)定溫度梯度分別為10、20、30、40和50°C。培養(yǎng)基滅菌后，添加已滅菌的終濃度 為100mg/L的孔雀石綠，接種等量菌株CV-v過夜培養(yǎng)物（菌體干重為0. 1-0. 2g/L)，并于 180rpm條件下震蕩培