專利名稱:胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及肝素鈉生產(chǎn)技術領域,特別涉及一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝。
背景技術:
肝素鈉又稱肝素,是一種含有硫酸基的酸性粘多糖類天然抗凝血物質(zhì)。肝素鈉為白色或類白色粉末,無臭無味,有引濕性,易溶于水,不溶于乙醇、丙酮、二氧六環(huán)等有機溶劑。肝素鈉廣泛存在于哺乳動物肝、肺、腸黏膜中,多與蛋白質(zhì)結合成復合體存在。酶解蛋白可分離肝素鈉,肝素鈉是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在PH8-9時,帶負電荷,可與陰離子交換劑進行離子交換,進行粗分離,多糖液在高濃度乙醇中沉淀進行精純。肝素鈉是血液化學成分測定中最好的抗凝劑。肝素鈉是一種含硫酸基團的黏多糖,分子量為1.5萬,其抗凝機制是與抗凝酶II一起,在低濃度能抑制因子IX a、VDI和PF3之間的作用,并能加強抗凝血酶III滅活絲氨酸蛋白酶,從而阻止凝血酶形成;還有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。 傳統(tǒng)的肝素鈉的酶解生產(chǎn)方法的缺陷是:生產(chǎn)周期長,能耗大,收率低,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品需2800-3000根豬小腸的粘膜,產(chǎn)品純度低,肝素鈉的效價至多為80U/mg,并產(chǎn)生大量的腸渣和廢水,污染環(huán)境。CN1308088A的發(fā)明公開了一種利用生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)肝素鈉的方法。該方法采用2709蛋白酶作為催化劑,D204強堿性陰離子交換樹脂作為離子交換樹脂,并采用150-180目多層布篩進行過濾。2709蛋白酶為人工合成物,降低了肝素鈉產(chǎn)品的天然性,而且采用2709蛋白酶酶解,生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的異味較大,污染環(huán)境。同時該方法的產(chǎn)品收率、純度也較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷,提供一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,生產(chǎn)周期短,產(chǎn)品收率、純度高,可以很大程度的減少生產(chǎn)過程中異味產(chǎn)生,利于環(huán)保,在提取中大大減少了人工合成物的使用,提高了產(chǎn)品的天然性。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,所述的工藝步驟如下:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟,去除表面殘留油脂,用絞肉機將其絞碎,將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:9-12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。(2)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐,豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:
2.5-4的重量比的混合物,向酶解罐中加入鹽度21° -24°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°,控制料液的pH在8.5 + 0.5 ;接著按每1000L料液加15 ± 5kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在53±3°C,鹽度4.2±0.2°,pH 7.0±0.5保持3±0.5小時;最后升溫至85-88°C,保持20_25min得酶解液,過濾去殘渣。本步驟最后酶解液過濾去殘渣時,往往采用布袋過濾去殘渣,這樣效率往往較低,發(fā)明人通過實踐探索,發(fā)明了采用振動篩過濾去殘渣的方式,大大提高了過濾速度,提高了生產(chǎn)效率,是代替布袋過濾的好方法。(3)吸附:將酶解液輸入吸附罐,降溫至57±3°C,加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°,控制pH 7.0-7.5,按每1000L酶解液加3_8kg的樹脂量,向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂,攪拌吸附6-8小時后,收集樹脂。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性,再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液,攪拌至少I小時進行洗滌,其中,樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3-1.7 (w/V)??刂坡然c溶液溫度在55-60°C,便于將樹脂表面油脂類的附著物清洗干凈,便于洗脫。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫,其中,第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時,樹月旨:氯化鈉溶液=1:1-1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液;控制兩次洗脫洗脫時的氯化鈉溶液溫度在55-60°C,便于將油脂狀的肝素鈉從樹脂上洗脫下來,增加得率。(6)沉淀:將步驟(5)收集到的洗脫液倒入沉淀罐中,攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準,靜置沉淀15小時以上,收集沉淀物。(7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1:8-10的重量比混合,充分溶解形成沉淀物溶液,向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽,攪拌均勻,腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質(zhì)量的1-3%;再加入酒精度85±5°的酒精再次沉淀,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準,靜置沉淀15小時以上,收集沉淀物。(8)干燥:步驟(7)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精進行脫水1-3小時,濾干后做烘干處理即得肝素鈉產(chǎn)品。本發(fā)明中的w/v為質(zhì)量體積比具體為:kg:L。本發(fā)明另辟蹊徑,采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液,再用于提取肝素鈉,這樣大大減少了人工合成物的使用,提高了產(chǎn)品的天然性;而且,采用本發(fā)明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉,可以很大程度的減少生產(chǎn)過程中異味產(chǎn)生,利于環(huán)保?,F(xiàn)有的肝素鈉生產(chǎn)過程的酒沉即沉淀步驟時,高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產(chǎn)品中,高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶不容易被從肝素鈉產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)并分離,這樣大大降低了肝素鈉產(chǎn)品的純度。本發(fā)明通過增加了重溶再沉淀步驟,能有效解決高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產(chǎn)品中導致產(chǎn)品純度較低的問題。經(jīng)本發(fā)明處理后的肝素鈉產(chǎn)品純度有明顯提高,肝素鈉的效價> 130U/mg。本發(fā)明采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液提取肝素鈉,收率高,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸。作為優(yōu)選,步驟(2)處理得到的酶解液在6000-8000轉/分的轉速下,離心處理20-40min后,再進入下 一步的吸附。酶解后得到乳濁狀液體,濾去殘渣后進入離心機,啟動離心機,酶解液在離心力作用下,使乳濁狀酶解液進入離心機轉鼓后,固體顆粒或密度較大的液體(含蛋白)向轉鼓壁沉降,形成沉洛,密度較小的肝素鈉分解液向轉鼓中心方向聚集,流至溢流口排出,成為分離液。沉渣通過蝸桿傳動把沉渣從排渣口擠壓出來,分離液通過離心機從出料口排出,輸送到吸附罐內(nèi)進行下一步樹脂吸附工序。增加本步驟后在分解工段中直接清除了部分雜質(zhì),使吸附工序中的樹脂能充分吸附肝素鈉,提高樹脂吸附有效性。在分解工序中直接進行雜質(zhì)的分離,提高最終產(chǎn)品的純度。控制離心速度和時間,保證離心分離的效果。作為優(yōu)選,將步驟(3)收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐,控制溫度在57±3°C,pH 7.0-7.5,按每1000L料液加2_3kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6-8小時后,收集樹脂,然后與步驟(3)收集的樹脂合并后,進入下一步的洗滌步驟。本步驟將樹脂吸附后的料液重新進行吸附,可以提高肝素鈉的收率,減少浪費,同時能減少廢液中蛋白的含量,利于廢水處理。作為優(yōu)選,所述羅門哈斯FPA98CL型樹脂活化處理后再使用,活化處理為:樹脂用50-60°C溫水浸泡20小時以上后用清水沖洗干凈并浙干,再加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個小時以上,最后用清水沖洗至洗液PH為中性,所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計;活化后的樹脂在4000-5000轉/分的轉速下,離心處理10-30min,再用于吸附。將活化處理后待使用的樹脂通過離心機進料口進入離心機。啟動離心機,樹脂在4000-5000轉/分鐘的轉速作用下,樹脂進入離心機轉鼓后,固體顆粒樹脂向轉鼓壁沉降,粘附在鼓壁內(nèi)。離心作用甩出 的液體或密度較小的物質(zhì)向轉鼓中心方向聚集,流至溢流口排出,成為廢物。收集留在鼓壁的樹脂,準備用于吸附工序。本步驟樹脂孔內(nèi)水分得到充分甩干,以增加樹脂的吸附空間,提高樹脂的吸附能力。作為優(yōu)選,步驟(5)收集的洗脫液進入超濾機超濾后再進入步驟(6)沉淀,超濾機的超濾膜孔徑在0.45 μ m-0.6 μ m。經(jīng)過超濾,可將洗脫液中的廢水和雜質(zhì)排除,有效提高產(chǎn)品的純度,并能減少下一步酒沉工藝中的酒精使用量,節(jié)約成本。作為優(yōu)選,步驟(5)收集的洗脫液在8000-10000轉/分的轉速下,離心處理10-20min后,再進入步驟(6)沉淀。把洗脫液通過離心機進料口進入離心機,啟動離心機,洗脫液在分解液在離心力(8000-10000轉/分)作用下,使乳濁狀洗脫液進入離心機轉鼓后,固體顆粒或密度較大的液體(含蛋白)向轉鼓壁沉降,形成沉渣,密度較小的肝素鈉洗脫液向轉鼓中心方向聚集,流至溢流口排出,成為分離液。沉渣通過蝸桿傳動把沉渣從排渣口擠壓出來,分離液通過離心機從出料口排出,輸送到沉淀罐內(nèi)進行下一步酒精沉淀工序。本步驟增加對洗脫液離心的工序,從而在洗脫工序中直接去除部分雜質(zhì)和蛋白,從而提高最終產(chǎn)品的純度,并能減少下一步酒沉工藝中的酒精使用量,節(jié)約成本。作為優(yōu)選,步驟(6)收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中,向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻,并調(diào)節(jié)pH為9-10,上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5-0.7,靜置沉淀8-12小時后,收集沉淀,然后與步驟(6)得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。
本步驟對第一次酒沉后的上清液再次進行酒沉,可有效提高肝素鈉的收率,減少浪費,利于廢水處理。作為優(yōu)選,步驟(8)烘干處理的溫度為60-80°C。作為優(yōu)選,收集步驟(2)酶解液過濾獲得的殘渣,向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液,然后將殘渣重新加入酶解罐中,殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5-6,控制料液的pH在8.5±0.5,接著按每1000L料液加10_12kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在55±1°C,保溫6-7小時;最后升溫至88-90°C,保持20-25min,再靜置20_30min后得酶解液,酶解液在6000-8000轉/分的轉速下,離心處理20-40min后,進入下一步的吸附?,F(xiàn)有工藝中,酶解剩余的殘渣即腸渣往往棄之不用,這樣較浪費且增加了環(huán)境的負擔。而本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過多年實踐探索,發(fā)明了一條有效再利用殘渣的工藝步驟,通過對殘渣的再次酶解處理,能更進一步分解殘渣,提取肝素鈉,增加了肝素鈉的收率,減少了廢物排放,利于環(huán)保。本發(fā)明的有益效果是:
1、采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液,再用于提取肝素鈉,這樣大大減少了人工合成物的使用,提高了產(chǎn)品的天然性;而且,采用本發(fā)明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉,可以很大程度的減少生產(chǎn)過程中異味產(chǎn)生,利于環(huán)保。2、收率高,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸。3、增加了重溶再沉淀步驟,能有效解決高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產(chǎn)品中導致產(chǎn)品純度較低的問題,產(chǎn)品純度高,肝素鈉的效價> 130U/mg。
具體實施例方式下面通過具體實施例,對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。本發(fā)明中,若非特指,所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法,如無特別說明,均為本領域的常規(guī)方法。樹脂活化處理:
將新的羅門哈斯FPA98CL型樹脂(市售進口樹脂,經(jīng)銷商北京博賽斯生物技術有限公司)用50°C溫水浸泡20小時后用清水沖洗干凈并浙干,再加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個小時以上,最后用清水沖洗至洗液PH為中性,所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計。研究表明,樹脂活化處理中采用的溫水溫度在50-60°C之間,浸泡時間在16-24小時之間,對樹脂的活化處理效果是等同的,在此不做——贅述?;罨蟮臉渲?000-5000轉/分的轉速下,離心處理10-30min,再用于吸附。實施例1:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟,去除表面殘留油脂,用絞肉機將其絞碎,將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:10的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。
(2)酶解:將1000L豬小腸粘膜漿液(由豬小腸經(jīng)刮腸機處理而得)加入酶解罐,豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1: 3的重量比的混合物,向酶解罐中加入鹽度22°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°,控制料液的pH在8.5左右;接著按每IOOOL料液加15kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在53°C,鹽度4.2±0.2° ,pH 7.0左右保持3小時;最后升溫至86°C,保持23min得酶解液,過濾去殘渣。然后酶解液在7000轉/分的轉速下,離心處理30min后,再進入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘渣,向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液,然后將殘渣重新加入酶解罐中,殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5,控制料液的pH在8.5左右,接著按每1000L料液加IOkg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在55°C,保溫6小時;最后升溫至90°C,保持22min,再靜置25min后得酶解液,酶解液在7000轉/分的轉速下,離心處理30min后,進入下一步的吸附(與豬小腸粘膜酶解得到的酶解液都輸入吸附罐)。(3)吸附:將酶解液輸入吸附罐,降溫至57°C,加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°,控制PH 7.0,按每1000L酶解液加5kg的樹脂量,向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂,攪拌吸附7小時后,收集樹脂;將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐,控制溫度在57°C,pH 7.0,按每1000L料液加2.5kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附7小時后,收集樹脂,然后與酶解液吸附收集的樹脂合并后,進入下一步的洗滌步驟。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性,再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液,攪拌2小時進行洗滌,其中,樹脂:氯化鈉溶液=1:1.5 (w/v)。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫,其中,第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液中攪拌4小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:1.2 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液中攪拌4小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:1.0(w/v);合并兩次收集的洗脫液。收集的洗脫液進入超濾機 超濾后再進入下一步沉淀,超濾機的超濾膜孔徑在
0.45 μ m-0.6 μ m。(6)沉淀:將收集到的洗脫液倒入沉淀罐中,攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85°的酒精,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到50°為準,靜置沉淀18小時,收集沉淀物。收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中,向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻,并調(diào)節(jié)PH為9,上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.6,靜置沉淀10小時后,收集沉淀,然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。(7)重溶再沉淀:將沉淀物冰=1:9的重量比混合,充分溶解形成沉淀物溶液,向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽,攪拌均勻,腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質(zhì)量的2%;再加入酒精度85°的酒精再次沉淀,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到50°為準,靜置沉淀18小時,收集沉淀物。(8)干燥:向沉淀物加入酒精度90°的酒精進行脫水2小時,濾干后80°C烘干即得肝素鈉產(chǎn)品。經(jīng)檢測,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸,產(chǎn)品純度高,肝素鈉的效價> 130U/mg
實施例2:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟,去除表面殘留油脂,用絞肉機將其絞碎,將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:9的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。(2)酶解:將2000L豬小腸粘膜漿液加入酶解罐,豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1: 2.5的重量比的混合物,向酶解罐中加入鹽度21°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°,控制料液的pH在8.0 ;接著按每1000L料液加IOkg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在50°C,鹽度4.2±0.2° ,pH 6.5保持3.5小時;最后升溫至85°C,保持25min得酶解液,過濾去 殘渣。然后酶解液在6000轉/分的轉速下,離心處理40min后,再進入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘渣,向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液,然后將殘渣重新加入酶解罐中,殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:6,控制料液的pH在8左右,接著按每1000L料液加12kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在54°C,保溫7小時;最后升溫至88°C,保持25min,再靜置30min后得酶解液,酶解液在6000轉/分的轉速下,離心處理40min后,進入下一步的吸附。(3)吸附:將酶解液輸入吸附罐,降溫至54°C,加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°,控制PH 7.5,按每1000L酶解液加3kg的樹脂量,向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂,攪拌吸附8小時后,收集樹脂;將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐,控制溫度在54°C,pH 7.5,按每1000L料液加2kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附8小時后,收集樹脂,然后與酶解液吸附收集的樹脂合并后進入下一步的洗滌步驟。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性,再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液,攪拌I小時進行洗漆,其中,樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3 (w/v)。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫,其中,第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液中攪拌5小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:1 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液中攪拌5小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8 (w/v);合并兩次收集的洗脫液。收集的洗脫液在8000轉/分的轉速下,離心處理20min后,再進入下一步沉淀。(6)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中,攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度80°的酒精,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45°為準,靜置沉淀20小時,收集沉淀物。收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中,向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻,并調(diào)節(jié)PH為10,上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5,靜置沉淀12小時后,收集沉淀,然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。(7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1:8的重量比混合,充分溶解形成沉淀物溶液,向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽,攪拌均勻,腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質(zhì)量的1%;再加入酒精度80°的酒精再次沉淀,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45°為準,靜置沉淀20小時,收集沉淀物。(8)干燥:向沉淀物加入酒精度85°的酒精進行脫水I小時,濾干后60°C烘干即得肝素鈉產(chǎn)品。經(jīng)檢測,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸,產(chǎn)品純度高,肝素鈉的效價> 130U/mg
實施例3:
(I)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟,去除表面殘留油脂,用絞肉機將其絞碎,將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。(2)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐,豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:4的重量比的混合物,向酶解罐中加入鹽度24°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°,控制料液的pH在9.0 ;接著按每1000L料液加20kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在56°C,鹽度4.2±0.2°,pH 7.5保持2.5小時;最后升溫至88 0C,保持20min得酶解液,過濾去殘渣。酶解液在8000轉/分的轉速下,離心處理20min后,再進入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘渣,向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液,然后將殘渣重新加入酶解罐中,殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1: 5,控制料液的PH在9,接著按每1000L料液加12kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在56°C,保溫6小時;最后升溫至90°C,保持20min,再靜置30min后得酶解液,酶解液在8000轉/分的轉速下,離心處理20min后,進入下一步的吸附。(3)吸附:將酶解 液輸入吸附罐,降溫至60°C,加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°,控制PH 7.0,按每1000L酶解液加8kg的樹脂量,向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂,攪拌吸附6小時后,收集樹脂;將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐,控制溫度在60°C, pH 7.0,按每1000L料液加3kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6小時后,收集樹脂,然后與酶解液吸附收集的樹脂合并后,進入下一步的洗滌步驟。(4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性,再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液,攪拌I小時進行洗漆,其中,樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.7 (w/v)。(5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫,其中,第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液中攪拌3小時,樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液中攪拌3小時,樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液。收集的洗脫液在10000轉/分的轉速下,離心處理IOmin后,再進入下一步沉淀。(6)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中,攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度90°的酒精,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到60°為準,靜置沉淀15小時,收集沉淀物。收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中,向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻,并調(diào)節(jié)PH為10,上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.7,靜置沉淀8小時后,收集沉淀,然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。(7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1: 10的重量比混合,充分溶解形成沉淀物溶液,向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽,攪拌均勻,腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質(zhì)量的3%;再加入酒精度90°的酒精再次沉淀,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到60°為準,靜置沉淀15小時,收集沉淀物。(8)干燥:向沉淀物加入酒精度90°的酒精進行脫水I小時,濾干后70°C烘干即
得肝素鈉產(chǎn)品。經(jīng)檢測,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸,產(chǎn)品純度高,肝素鈉的效價> 130U/mg本發(fā)明大大減少了人工合成物的使用,提高了產(chǎn)品的天然性;而且,采用本發(fā)明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉,可以很大程度的減少生產(chǎn)過程中異味產(chǎn)生,利于環(huán)保。以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案,并非對本發(fā)明作任何形式上的限制,在不超出權利要求所記載的`技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
權利要求
1.一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:所述的工藝步驟如下: (1)胰蛋白酶酶液制備:取新鮮豬胰臟,去除表面殘留油脂,用絞肉機將其絞碎,將絞碎的豬胰臟:飽和石灰水=1:9-12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液; (2)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐,豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:2.5-4的重量比的混合物,向酶解罐中加入鹽度21° -24°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°,控制料液的pH在8.5 + 0.5 ;接著按每1000L料液加15±5kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在53±3°C,鹽度4.2±0.2°,pH 7.0±0.5保持3±0.5小時;最后升溫至85-88°C,保持20_25min得酶解液,過濾去殘渣; (3)吸附:將酶解液輸入吸附罐,降溫至57±3°C,加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°,控制pH7.0-7.5,按每1000L酶解液加3-8kg的樹脂量,向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂,攪拌吸附6-8小時后,收集樹脂; (4)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性,再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液,攪拌至少I小時進行洗滌,其中,樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3-1.7 (w/V); (5)洗脫:將步驟(4)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫,其中,第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:1-1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉 溶液中攪拌至少3小時,樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液; (6)沉淀:將步驟(5)收集到的洗脫液倒入沉淀罐中,攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準,靜置沉淀15小時以上,收集沉淀物; (7)重溶再沉淀:將沉淀物:水=1:8-10的重量比混合,充分溶解形成沉淀物溶液,向沉淀物溶液中加入腸衣專用鹽,攪拌均勻,腸衣專用鹽的用量為沉淀物溶液質(zhì)量的1-3%;再加入酒精度85±5°的酒精再次沉淀,酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準,靜置沉淀15小時以上,收集沉淀物; (8)干燥:步驟(7)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精進行脫水1-3小時,濾干后做烘干處理即得肝素鈉產(chǎn)品。
2.根據(jù)權利要求1所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:步驟(2)處理得到的酶解液在6000-8000轉/分的轉速下,離心處理20-40min后,再進入下一步的吸附。
3.根據(jù)權利要求1所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:將步驟(3)收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐,控制溫度在57±3°C,pH 7.0-7.5,按每1000L料液加2-3kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6_8小時后,收集樹脂,然后與步驟(3)收集的樹脂合并后,進入下一步的洗滌步驟。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:所述羅門哈斯FPA98CL型樹脂活化處理后再使用,活化處理為:樹脂用50-60°C溫水浸泡20小時以上后用清水沖洗干凈并浙干,再加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌1個小時以上,最后用清水沖洗至洗液pH為中性,所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計;活化后的樹脂在4000-5000轉/分的轉速下,離心處理10-30min,再用于吸附。
5.根據(jù)權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:步驟(5)收集的洗脫液進入超濾機超濾后再進入步驟(6)沉淀,超濾機的超濾膜孔徑在 0.45 μ m-0.6 μ m。
6.根據(jù)權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:步驟(5)收集的洗脫液在8000-10000轉/分的轉速下,離心處理10-20min后,再進入步驟(6)沉淀。
7.根據(jù)權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:步驟(6)收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中,向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻,并調(diào)節(jié)pH為9-10,上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5-0.7,靜置沉淀8-12小時后,收集沉淀,然后與步驟(6)得到的沉淀物合并后進入下一步的重溶再沉淀。
8.根據(jù)權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:步驟(8)烘干處理的溫度為60-80°C。
9.根據(jù)權利要求1或2或3所述的胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝,其特征在于:收集步驟(2)酶解液過濾獲得的殘渣,向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液,然后將殘渣重新加入酶解罐中,殘渣與鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5-6,控制料液的PH在8.5±0.5,接著按每1000L料液加10_12kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入胰蛋白酶酶液,控制料液溫度在55土 1°C,保溫6-7小時;最后升溫至88-90°C,保持20_25min,再靜置20-30min后得酶解液,酶解液在6000-8000轉/分的轉速下,離心處理20_40min后,進入下一步的吸附。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝素鈉生產(chǎn)技術領域,提供了一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取高純肝素鈉的工藝。本發(fā)明另辟蹊徑,采用新鮮豬胰臟為原料制取胰蛋白酶酶液,再用于提取肝素鈉,這樣大大減少了人工合成物的使用,提高了產(chǎn)品的天然性,收率高,生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸;而且,采用本發(fā)明的胰蛋白酶酶液提取肝素鈉,可以很大程度的減少生產(chǎn)過程中異味產(chǎn)生,利于環(huán)保。本發(fā)明通過增加了重溶再沉淀步驟,能有效解決高濃度的酒精和洗脫液容易形成鹽結晶混在肝素鈉產(chǎn)品中導致產(chǎn)品純度較低的問題。經(jīng)本發(fā)明處理后的肝素鈉產(chǎn)品純度有明顯提高,肝素鈉的效價>130U/mg。
文檔編號C08B37/10GK103183747SQ201210347348
公開日2013年7月3日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權日2012年9月19日
發(fā)明者花瑞華, 潘為群, 潘為中 申請人:杭州龍揚生物科技有限公司