專利名稱：堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝素鈉生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝。
背景技術(shù)：
肝素鈉又稱肝素，是一種含有硫酸基的酸性粘多糖類天然抗凝血物質(zhì)。肝素鈉為白色或類白色粉末，無臭無味，有引濕性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六環(huán)等有機(jī)溶劑。肝素鈉廣泛存在于哺乳動(dòng)物肝、肺、腸黏膜中，多與蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合體存在。酶解蛋白可分離肝素鈉，肝素鈉是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在PH8-9時(shí)，帶負(fù)電荷，可與陰離子交換劑進(jìn)行離子交換，進(jìn)行粗分離，多糖液在高濃度乙醇中沉淀進(jìn)行精純。肝素鈉是血液化學(xué)成分測定中最好的抗凝劑。肝素鈉是一種含硫酸基團(tuán)的黏多糖，分子量為1.5萬，其抗凝機(jī)制是與抗凝酶II一起，在低濃度能抑制因子IX a、VDI和PF3之間的作用，并能加強(qiáng)抗凝血酶III滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成；還有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。

傳統(tǒng)的肝素鈉的酶解生產(chǎn)方法的缺陷是:生產(chǎn)周期長，能耗大，收率低，生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品需2800-3000根豬小腸，產(chǎn)品純度低，肝素鈉的效價(jià)至多為80U/mg，并產(chǎn)生大量的腸渣和廢水，污染環(huán)境。CN1308088A的發(fā)明公開了一種利用生物發(fā)酵工藝生產(chǎn)肝素鈉的方法。該方法采用2709蛋白酶作為催化劑，D204強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂作為離子交換樹脂，并采用150-180目多層布篩進(jìn)行過濾。該方法存在的缺陷是:產(chǎn)品收率、純度也較低，并產(chǎn)生大量的腸渣和廢水，污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收率、純度高，減少了腸渣和廢水的排放，利于環(huán)保。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，所述的工藝步驟如下:
(O酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:
2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21° -24°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5±0.5 ;接著按每1000L料液加1.2±0.4kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在53 ±3°C，鹽度4.2 ±0.2 °，pH
7.0±0.5保持3±0.5小時(shí)；最后升溫至85-88 °C，保持20_25min得酶解液，過濾去殘?jiān)?。本步驟最后酶解液過濾去殘?jiān)鼤r(shí)，往往采用布袋過濾去殘?jiān)@樣效率往往較低，發(fā)明人通過實(shí)踐探索，發(fā)明了采用振動(dòng)篩過濾去殘?jiān)姆绞?，大大提高了過濾速度，提高了生產(chǎn)效率，是代替布袋過濾的好方法。
(2)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至57±3°C，加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°，控制pH 7.0-7.5，按每1000L酶解液加3_8kg的樹脂量，向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6-8小時(shí)后，收集樹脂。(3)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液，攪拌至少I小時(shí)進(jìn)行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3-1.7 (w/
V);控制氯化鈉溶液溫度在55-60 V，便于將樹脂表面油脂類的附著物清洗干凈，便于洗脫。(4)洗脫:將步驟(3)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進(jìn)行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時(shí)，樹月旨:氯化鈉溶液=1:1_1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液；控制兩次洗脫洗脫時(shí)的氯化鈉溶液溫度在55-60°C，便于將油脂狀的肝素鈉從樹脂上洗脫下來，增加得率。(5)沉淀:將步驟(4)收集到的洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以 實(shí)測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準(zhǔn)，靜置沉淀15小時(shí)以上，收集沉淀物。(6)干燥:步驟(5)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精進(jìn)行脫水1-3小時(shí)，濾干后做烘干處理即得肝素鈉產(chǎn)品。本發(fā)明中的w/v為質(zhì)量體積比具體為:kg:L。本發(fā)明以豬小腸粘膜為原料，通過優(yōu)化工藝，來制備肝素鈉，收率高，生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，產(chǎn)品純度高，肝素鈉的效價(jià)> 110U/mg。作為優(yōu)選，步驟(I)處理得到的酶解液在6000-8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理20-40min后，再進(jìn)入下一步的吸附。酶解后得到乳濁狀液體，濾去殘?jiān)筮M(jìn)入離心機(jī)，啟動(dòng)離心機(jī)，酶解液在離心力作用下，使乳濁狀酶解液進(jìn)入離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓后，固體顆粒或密度較大的液體(含蛋白)向轉(zhuǎn)鼓壁沉降，形成沉洛，密度較小的肝素鈉分解液向轉(zhuǎn)鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成為分離液。沉渣通過蝸桿傳動(dòng)把沉渣從排渣口擠壓出來，分離液通過離心機(jī)從出料口排出，輸送到吸附罐內(nèi)進(jìn)行下一步樹脂吸附工序。增加本步驟后在分解工段中直接清除了部分雜質(zhì)，使吸附工序中的樹脂能充分吸附肝素鈉，提高樹脂吸附有效性。在分解工序中直接進(jìn)行雜質(zhì)的分離，提高最終產(chǎn)品的純度。控制離心速度和時(shí)間，保證離心分離的效果。作為優(yōu)選，將步驟(2)收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在57±3°C，pH 7.0-7.5，按每1000L料液加2_3kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6-8小時(shí)后，收集樹脂，然后與步驟(2)收集的樹脂合并后，進(jìn)入下一步的洗滌步驟。本步驟將樹脂吸附后的料液重新進(jìn)行吸附，可以提高肝素鈉的收率，減少浪費(fèi)，同時(shí)能減少廢液中蛋白的含量，利于廢水處理。作為優(yōu)選，所述羅門哈斯FPA98CL型樹脂活化處理后再使用，活化處理為:樹脂用50-60°C溫水浸泡20小時(shí)以上后用清水沖洗干凈并浙干,再加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個(gè)小時(shí)以上，最后用清水沖洗至洗液PH為中性，所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計(jì)；活化后的樹脂在4000-5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理10-30min,再用于吸附。將活化處理后待使用的樹脂通過離心機(jī)進(jìn)料口進(jìn)入離心機(jī)。啟動(dòng)離心機(jī)，樹脂在4000-5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速作用下，樹脂進(jìn)入離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓后，固體顆粒樹脂向轉(zhuǎn)鼓壁沉降，粘附在鼓壁內(nèi)。離心作用甩出的液體或密度較小的物質(zhì)向轉(zhuǎn)鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成為廢物。收集留在鼓壁的樹脂，準(zhǔn)備用于吸附工序。本步驟樹脂孔內(nèi)水分得到充分甩干，以增加樹脂的吸附空間，提高樹脂的吸附能力。作為優(yōu)選，步驟(4)收集的洗脫液進(jìn)入超濾機(jī)超濾后再進(jìn)入步驟(5)沉淀，超濾機(jī)的超濾膜孔徑在0.45 μ m-0.6 μ m。經(jīng)過超濾，可將洗脫液中的廢水和雜質(zhì)排除，有效提高產(chǎn)品的純度，并能減少下一步酒沉工藝中的酒精使用量，節(jié)約成本。作為優(yōu)選，步驟(4)收集的洗脫液在8000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理10-20min后，再進(jìn)入步驟(5)沉淀。把洗脫液通過離心機(jī)進(jìn)料口進(jìn)入離心機(jī)，啟動(dòng)離心機(jī)，洗脫液在分解液在離心力(8000-10000轉(zhuǎn)/分)作用下，使乳濁狀洗脫液進(jìn)入離心機(jī)轉(zhuǎn)鼓后，固體顆粒或密度較大的液體(含蛋白)向轉(zhuǎn)鼓壁沉降，形成沉渣，密度較小的肝素鈉洗脫液向轉(zhuǎn)鼓中心方向聚集，流至溢流口排出，成為分離液。沉渣通過蝸桿傳動(dòng)把沉渣從排渣口擠壓出來，分離液通過離心機(jī)從出料口排出，輸送到沉淀罐內(nèi)進(jìn)行下一步酒精沉淀工序。本步驟增加對洗脫液離心的工序，從而在洗脫工序中直接去除部分雜質(zhì)和蛋白，從而提高最終產(chǎn)品的純度，并能減少下一步酒沉工藝中的酒精使用量，節(jié)約成本。作為優(yōu)選，步驟(5)收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶 液攪拌均勻，并調(diào)節(jié)pH為9-10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5-0.7，靜置沉淀8-12小時(shí)后，收集沉淀，然后與步驟(5)收集的沉淀物合并后進(jìn)入下一步的干燥。本步驟對第一次酒沉后的上清液再次進(jìn)行酒沉，可有效提高肝素鈉的收率，減少浪費(fèi)，利于廢水處理。作為優(yōu)選，步驟(6)烘干處理的溫度為60_80°C。作為優(yōu)選，收集步驟(I)酶解液過濾獲得的殘?jiān)?，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘?jiān)匦录尤朊附夤拗?，殘?jiān)c鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5-6，控制料液的pH在8.5±0.5，接著按每1000L料液加1.0-1.2kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在55 ± I °C，保溫6-7小時(shí)；最后升溫至88-90°C，保持20-25min，再靜置20_30min后得酶解液，酶解液在6000-8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理20-40min后,進(jìn)入下一步的吸附?，F(xiàn)有工藝中，酶解剩余的殘?jiān)茨c渣往往棄之不用，這樣較浪費(fèi)且增加了環(huán)境的負(fù)擔(dān)。而本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過多年實(shí)踐探索，發(fā)明了一條有效再利用殘?jiān)墓に嚥襟E，通過對殘?jiān)脑俅蚊附馓幚?，能更進(jìn)一步分解殘?jiān)崛「嗡剽c，增加了肝素鈉的收率，減少了廢物排放，利于環(huán)保。本發(fā)明的有益效果是:
1、通過優(yōu)化工藝制備肝素鈉，收率高，生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸。2、產(chǎn)品純度高，肝素鈉的效價(jià)> 110U/mg。3、殘?jiān)脑俅蚊附馓崛。芨M(jìn)一步分解殘?jiān)?，提取肝素鈉，增加了肝素鈉的收率，減少了廢物排放，利于環(huán)保。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。樹脂活化處理:
將新的羅門哈斯FPA98CL型樹脂(市售進(jìn)口樹脂，經(jīng)銷商北京博賽斯生物技術(shù)有限公司)用50°C溫水浸泡20小時(shí)后用清水沖洗干凈并浙干，再加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個(gè)小時(shí)以上，最后用清水沖洗至洗液PH為中性，所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計(jì)。研究表明，樹脂活化處理中采用的溫水溫度在50-60°C之間，浸泡時(shí)間在16-24小時(shí)之間，對樹脂的活化處理效果是等同的，在此不做——贅述?；罨蟮臉渲?000-5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理10-30min，再用于吸附。實(shí)施例1:
(O酶解:將2000L豬小腸粘膜漿液(由豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理而得)加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1: 2.5的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8左右；接著按每1000L料液加0.8k g的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在56°C，鹽度
4.2±0.2°，pH 6.5保持2.5小時(shí)；最后升溫至85°C，保持25min得酶解液，過濾去殘?jiān)?；然后酶解液?000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理40min后，再進(jìn)入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘?jiān)蛎附夤拗屑尤臌}度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘?jiān)匦录尤朊附夤拗?，殘?jiān)c鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5，控制料液的pH在8左右，接著按每1000L料液加1.0kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在56°C，保溫6小時(shí)；最后升溫至88°C，保持25min，再靜置30min后得酶解液，酶解液在6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理40min后，進(jìn)入下一步的吸附。(2)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至54°C，加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°，控制PH 7.0，按每1000L酶解液加3kg的樹脂量，向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附8小時(shí)后，收集樹脂；將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在54°C, pH 7.0，按每1000L料液加2kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附8小時(shí)后，收集樹脂，然后與吸附酶解液收集的樹脂合并后，進(jìn)入下一步的洗滌步驟。(3)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液，攪拌3小時(shí)進(jìn)行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3 (w/v)；
(4)洗脫:將步驟(3)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進(jìn)行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液中攪拌5小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:1 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55°C的氯化鈉溶液中攪拌5小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8 (w/v);合并兩次收集的洗脫液；
收集的洗脫液進(jìn)入超濾機(jī)超濾后再進(jìn)入下一步沉淀，超濾機(jī)的超濾膜孔徑在0.45 μ m-0.6 μ m。(5)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度80°的酒精，酒精用量以實(shí)測沉淀罐中混合液的酒精度到45°為準(zhǔn)，靜置沉淀20小時(shí)，收集沉淀物；收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調(diào)節(jié)PH為9，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5，靜置沉淀12小時(shí)后，收集沉淀，然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進(jìn)入下一步的干燥。(6)干燥:向沉淀物加入酒精度85°的酒精進(jìn)行脫水3小時(shí)，濾干后60°C烘干即得肝素鈉產(chǎn)品。經(jīng)檢測，生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，肝素鈉的效價(jià)>110U/mg。
實(shí)施例2:
(O酶解:將1000L豬小腸粘膜漿液(由豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理而得)加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1: 4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度24°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在9左右；接著按每1000L料液加1.6kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在50°C，鹽度
4.2±0.2。,pH 7.5保持3.5小時(shí)；最后升溫至88°C，保持20min得酶解液，過濾去殘?jiān)蝗缓竺附庖涸?000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理20min后，再進(jìn)入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘?jiān)?，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘?jiān)匦录尤朊附夤拗校瑲堅(jiān)c鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:6，控制料液的pH在9左右，接著按每1000L料液加1.2kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在54°C，保溫7小時(shí)；最后升溫至90°C，保持20min，再靜置20min后得酶解液，酶解液在8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理20min后，進(jìn)入下一步的吸附。(2)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至60°C，加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°，控制PH7.5，按每1000L酶解液加8kg的樹脂量，向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6小時(shí)后，收集樹脂；將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在60°C，pH 7.5,按每1000L料液加3kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6小時(shí)后，收集樹脂，然后與吸附酶解液收集的樹脂合并后，進(jìn)入下一步的洗滌步驟。(3)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液,攪拌I小時(shí)進(jìn)行洗漆，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.7 (w/v)；
(4)洗脫:將步驟(3)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進(jìn)行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液中攪拌3小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度60°C的氯化鈉溶液中攪拌3小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1: 1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液；
收集的洗脫液在8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下， 離心處理20min后，再進(jìn)入下一步沉淀。(5)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度90°的酒精，酒精用量以實(shí)測沉淀罐中混合液的酒精度到60°為準(zhǔn)，靜置沉淀15小時(shí)，收集沉淀物；收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調(diào)節(jié)PH為10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.7，靜置沉淀8小時(shí)后，收集沉淀，然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進(jìn)入下一步的干燥。(6)干燥:向沉淀物加入酒精度90°的酒精進(jìn)行脫水I小時(shí)，濾干后80°C烘干即得肝素鈉產(chǎn)品。經(jīng)檢測，生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，肝素鈉的效價(jià)>110U/mg。
實(shí)施例3:
(O酶解:將1500L豬小腸粘膜漿液(由豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理而得)加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:3的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度22°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5左右；接著按每1000L料液加1.2kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在53°C，鹽度4.2±0.2° ,pH 7.0左右保持3小時(shí)；最后升溫至86°C，保持22min得酶解液，過濾去殘?jiān)?；然后酶解液?000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理30min后，再進(jìn)入下一步的吸附。收集酶解液過濾獲得的殘?jiān)?，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘?jiān)匦录尤朊附夤拗?，殘?jiān)c鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5.5，控制料液的pH在8.5，接著按每1000L料液加1.1kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在55°C，保溫6.5小時(shí)；最后升溫至89°C，保持22min，再靜置25min后得酶解液，酶解液在7000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn) 速下，離心處理30min后，進(jìn)入下一步的吸附。(2)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至57°C，加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°，控制PH 7.0左右，按每1000L酶解液加5kg的樹脂量，向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹月旨，攪拌吸附7小時(shí)后，收集樹脂；將收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在57°C，pH 7.0左右，按每1000L料液加2.5kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附7小時(shí)后，收集樹脂，然后與吸附酶解液收集的樹脂合并后，進(jìn)入下一步的洗滌步驟。(3)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液，攪拌2小時(shí)進(jìn)行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.5 (w/v)；
(4)洗脫:將步驟(3)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進(jìn)行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液中攪拌4小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.2 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度58°C的氯化鈉溶液中攪拌4小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:1 (w/v);合并兩次收集的洗脫液；
收集的洗脫液在10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理IOmin后，再進(jìn)入下一步沉淀。(5)沉淀:將洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85°的酒精，酒精用量以實(shí)測沉淀罐中混合液的酒精度到50°為準(zhǔn)，靜置沉淀18小時(shí)，收集沉淀物；收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調(diào)節(jié)PH為9，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.6，靜置沉淀10小時(shí)后，收集沉淀，然后與洗脫液沉淀得到的沉淀物合并后進(jìn)入下一步的干燥。(6)干燥:向沉淀物加入酒精度85°的酒精進(jìn)行脫水2小時(shí)，濾干后70°C烘干即得肝素鈉產(chǎn)品。經(jīng)檢測，生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，肝素鈉的效價(jià)>110U/mg。以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所 記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
權(quán)利要求
1.一種堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:所述的工藝步驟如下: (1)酶解:將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜:水=1:2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21° -24°的氯化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5±0.5 ;接著按每IOOOL料液加1.2±0.4kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在53 ±3°C，鹽度4.2 ±0.2 °，pH7.0±0.5保持3±0.5小時(shí)；最后升溫至85-88°C，保持20_25min得酶解液，過濾去殘?jiān)? (2)吸附:將酶解液輸入吸附罐，降溫至57±3°C，加水調(diào)節(jié)鹽度至3.0±0.5°，控制pH7.0-7.5，按每1000L酶解液加3-8kg的樹脂量，向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6-8小時(shí)后，收集樹脂； (3)洗滌:將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液，攪拌至少I小時(shí)進(jìn)行洗滌，其中，樹脂:氯化鈉溶液=1:1.3-1.7 (w/V); (4)洗脫:將步驟(3)洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進(jìn)行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為:將樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:1-1.4 (w/v);第二次洗脫為:將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21 ±1°、溫度55-60°C的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時(shí)，樹脂:氯化鈉溶液=1:0.8-1.2 (w/v);合并兩次收集的洗脫液； (5)沉淀:將步驟(4)收集到的洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以實(shí)測沉淀罐中混合液的酒精度到45° -60°為準(zhǔn)，靜置沉淀15小時(shí)以上，收集沉淀物； (6)干燥:步驟(5)收集的沉淀物加入酒精度85°以上的酒精進(jìn)行脫水1-3小時(shí)，濾干后做烘干處理即得肝素鈉產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(I)處理得到的酶解液在6000-8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理20-40min后，再進(jìn)入下一步的吸附。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:將步驟(2)收集樹脂后剩余的料液重新輸送至吸附罐，控制溫度在57±3°C，pH 7.0-7.5，按每1000L料液加2-3kg的樹脂量向吸附罐內(nèi)加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂再次吸附6_8小時(shí)后，收集樹脂，然后與步驟(2)收集的樹脂合并后，進(jìn)入下一步的洗滌步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:所述羅門哈斯FPA98CL型樹脂活化處理后再使用，活化處理為:樹脂用50-60°C溫水浸泡20小時(shí)以上后用清水沖洗干凈并浙干，再加入質(zhì)量濃度為10%的氫氧化鈉溶液攪拌I個(gè)小時(shí)以上，最后用清水沖洗至洗液PH為中性，所述氫氧化鈉溶液的加入量為每千克樹脂加入IL氫氧化鈉溶液的量計(jì)；活化后的樹脂在4000-5000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理10-30min，再用于吸附。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(4)收集的洗脫液進(jìn)入超濾機(jī)超濾后再進(jìn)入步驟(5)沉淀，超濾機(jī)的超濾膜孔徑在 0.45 μ m-0.6 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(4)收集的洗脫液在8000-10000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理10-20min后，再進(jìn)入步驟(5)沉淀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(5)收集沉淀物后剩余的上清液輸入另一空沉淀罐中，向另一空沉淀罐中加入飽和氯化鈉溶液攪拌均勻，并調(diào)節(jié)PH為9-10，上清液與飽和氯化鈉溶液的體積比為1:0.5-0.7，靜置沉淀8-12小時(shí)后，收集沉淀，然后與步驟(5)收集的沉淀物合并后進(jìn)入下一步的干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:步驟(6)烘干處理的溫度為60-80°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，其特征在于:收集步驟(I)酶解液過濾獲得的殘?jiān)?，向酶解罐中加入鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液，然后將殘?jiān)匦录尤朊附夤拗?，殘?jiān)c鹽度5±0.5°的氯化鈉溶液的重量比為1:5-6，控制料液的PH在8.5±0.5，接著按每1000L料液加1.0-1.2kg的酶量向酶解罐內(nèi)加入2709堿性蛋白酶，控制料液溫度在55土 1°C，保溫6-7小時(shí)；最后升溫至88-90°C，保持20_25min，再靜置20-30min后得酶解液，酶解液在6000-8000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心處理20_40min后，進(jìn)入下 一步的吸附。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝素鈉生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種堿性蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝。本發(fā)明主要步驟為酶解、吸附、洗滌、洗脫、沉淀和干燥。本發(fā)明生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品收率、純度高，減少了腸渣和廢水的排放，利于環(huán)保。生產(chǎn)一億國際單位肝素鈉粗品只需1600根左右豬小腸，肝素鈉的效價(jià)＞110U/mg。
文檔編號C08B37/10GK103183745SQ20121034734
公開日2013年7月3日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者花瑞華, 潘為群, 潘為中 申請人:杭州龍揚(yáng)生物科技有限公司