作為肺腺癌診治靶標(biāo)的clec9a基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及人CLEC9A基因在肺腺癌診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的疾病。我國(guó)每年癌癥發(fā)病人數(shù)約160萬(wàn)。惡 性腫瘤正超過(guò)心血管病成為致死原因的第一位。癌癥的防治和研宄正成為全世界科學(xué)家日 益關(guān)注的課題。肺腺癌（lung adenocarcinoma)是肺癌的一種，屬于非小細(xì)胞癌，腺癌大約 占肺原發(fā)腫瘤的40%。不同于鱗狀細(xì)胞肺癌，肺腺癌較容易發(fā)生于女性及不抽煙者。起源 于支氣管粘膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管的粘液腺。發(fā)病率比鱗癌和未分化癌低，發(fā)病年齡 較小，女性相對(duì)多見(jiàn)。多數(shù)腺癌起源于較小的支氣管，為周?chē)头伟Ｔ缙谝话銢](méi)有明顯的 臨床癥狀，往往在胸部X線檢查時(shí)被發(fā)現(xiàn)。
[0003] 對(duì)于肺癌的診斷檢查，臨床上常用的方法有以下幾種：（l)x線檢查；（2)支氣管鏡 檢查；（3)放射性核素檢查；(4)細(xì)胞學(xué)檢查；（5)剖胸探查術(shù)；(6) ECT檢查；（7)縱隔鏡檢 查。但是上述診斷方法均不能滿(mǎn)足對(duì)肺癌早期診斷的這種要求。因此目前非常有必要尋找 適合肺癌早期診斷的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng) 險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的基因標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的肺癌診斷方 法，使用基因標(biāo)志物來(lái)診斷肺腺癌的轉(zhuǎn)移具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在癌癥 早期就能預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防措施。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種人CLEC9A基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判 斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0007] 進(jìn)一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜 交或芯片預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品。
[0008] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌 轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增CLEC9A基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR預(yù) 判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品至少包括一對(duì) 特異擴(kuò)增CLEC9A基因的引物；所述用免疫檢測(cè)預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn) 移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品包括：與CLEC9A蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位 雜交預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品包括： 與CLEC9A基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否 轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移是否復(fù)發(fā)的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與 CLEC9A蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與CLEC9A基因的核酸序列雜交的探針。
[0009] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒。
[0010] 本發(fā)明還提供了人CLEC9A基因在高通量測(cè)序平臺(tái)中的應(yīng)用。隨著高通量測(cè)序技 術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正 常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知 人CLEC9A基因的異常與肺腺癌相關(guān)也屬于人CLEC9A基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還提供了人CLEC9A基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備預(yù)防肺腺癌轉(zhuǎn)移、治療肺腺 癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步，所述藥物包括：含有人CLEC9A基因的藥物、攜帶人CLEC9A基因的載體或 宿主細(xì)胞所形成的藥物、人CLEC9A蛋白質(zhì)藥物、或其他能夠促進(jìn)CLEC9A基因表達(dá)的藥物。 本發(fā)明的藥物可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的人CLEC9A蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高人CLEC9A蛋 白的表達(dá)，從而治療因人CLEC9A蛋白缺乏導(dǎo)致的肺腺癌的轉(zhuǎn)移。
[0013] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
[0015] 進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，這類(lèi)載體包括（但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨 化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣 和鎂、聚乙二醇等。
[0016] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可以分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方式 包括將含有人CLEC9A基因的藥物或者含有人CLEC9A蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞 移植或回輸?shù)襟w內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有人CLEC9A基因的藥物或者含有人CLEC9A蛋 白質(zhì)的藥物注入體內(nèi)組織中。
[0017] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療肺腺癌轉(zhuǎn)移的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大 大提到治療的成功率。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn) 移是否復(fù)發(fā)的芯片，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及 固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)CLEC9A基因轉(zhuǎn)錄水平 的針對(duì)CLEC9A基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體 的CLEC9A蛋白的特異性抗體。
[0019] 進(jìn)一步，所述基因芯片可用于檢測(cè)包括人CLEC9A基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括人CLEC9A蛋 白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與 肺腺癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高肺腺癌診斷的準(zhǔn)確率。
[0020] 本發(fā)明提供了一種預(yù)判肺腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、判斷肺腺癌是否轉(zhuǎn)移、判斷肺腺癌轉(zhuǎn)移 是否復(fù)發(fā)的試劑盒，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因 檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)CLEC9A基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括 CLEC9A蛋白的特異性抗體。
[0021] 進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方 法檢測(cè)CLEC9A基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)CLEC9A基因 的引物和/或探針。根據(jù)SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè) CLEC9A基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0022] 與CLEC9A基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或 其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述 探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最 長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0023] 進(jìn)一步，所述CLEC9A蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述 CLEC9A蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗 體、80?￥、？&13、？(313'）2、？￥等。只要所述片段能夠保留與〇^：9六蛋白的結(jié)合能力即可。用 于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制 備所述抗體。
[0024] 在本發(fā)明的上下文中，"CLEC9A基因"包括人CLEC9A基因以及人CLEC9A基因的任 何功能等同物的多核苷酸。CLEC9A基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中 CLEC9A基因（NC_000012. 12)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA 序列；
[0025] 優(yōu)選地，CLEC9A基因的編碼序列包括以下任 種DNA分子：
[0026] (1)序列表中SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；
[0027] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0028] (3)與（1)或⑵限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0029] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述CLEC9A基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，CLEC9A基因表達(dá)產(chǎn)物包括人CLEC9A蛋白以及人CLEC9A蛋 白的部分肽。所述CLEC9A蛋白的部分肽含有與肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能域。
[0031] "CLEC9A蛋白"包括人CLEC9A蛋白以及人CLEC9A蛋白的任何功能等同物。所述 功能等同物包括人CLEC9A蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位 變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人CLEC9A的DNA雜交的DNA 所編碼的蛋白質(zhì)。
[0032] 優(yōu)選地，CLEC9A蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0033] (1)由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0034] (2)將SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO. 2所示 的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地 1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0035] (3)與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性（又稱(chēng)為序列同一 性），更優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、 97%、98%、99%同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0036] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述CLEC9A蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)。
[0037] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0038] 通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是CLEC9A蛋白的 融合蛋白。對(duì)于與CLEC9A蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合