葡萄枝條rna的提取方法
【專利說明】葡萄枝條RNA的提取方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及葡萄枝條RNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0003]獲得完整性好、純度高的總RNA是開展葡萄功能基因的克隆、分子表達機理和生物信息學(xué)研宄的前提。植物RNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、氯化鋰沉淀法、異硫氰酸胍法、Trizol法、Bizol法等。由于葡萄組織結(jié)構(gòu)的特殊性及組織中多糖、多酚等物質(zhì)含量較高，用這些方法很難提取到高質(zhì)量的RNA。
[0004]葡萄枝條是研宄葡萄抗逆性和生長發(fā)育規(guī)律的重要材料，從枝條韌皮部和形成層提取RNA是目前葡萄分子生物學(xué)研宄的一個重要方面。近年來，商業(yè)化RNA提取試劑盒在一些植物樣品RNA提取中已被證明具有簡單快捷、試驗重復(fù)性較好的優(yōu)點，但在葡萄枝條中很難提取到高質(zhì)量的RNA，甚至提取不到葡萄RNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，利用CTAB對葡萄細胞裂解效果好的特點，從抑制提取過程中組多酚物質(zhì)的氧化褐變、利用2-丁氧乙醇除去多糖等方面著手，提供了一種葡萄枝條RNA的提取方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:葡萄枝條RNA的提取方法，包括以下步驟:
1)稱取0.2g葡萄韌皮部與形成層混合樣置入研缽中，加入聚乙烯吡咯烷酮固體粉末
0.02 g后，迅速倒入液氮進行充分研磨，然后將粉末轉(zhuǎn)入2 ml離心管中，加入預(yù)熱至65°C的2 % CTAB提取液700 μ I和20°C的β -巰基乙醇20 μ 1，顛倒混勻后，在65°C金屬浴30min，每隔5 min取出渦旋混勻I次；
2)取出步驟I)得到的渦旋混勻后的離心管放在冰上，迅速加入5M醋酸鉀溶液300μ I和2- 丁氧乙醇300 μ 1，渦旋振蕩，混勻后在-20 °C條件下靜置30min ;
3)在步驟2)得到的靜置后離心管中，加入200μ I CHCl3，4°C、15000rpm離心10 min ；
4)將步驟3)得到的離心液，取上清，加入800μ I CHCl3,4°C、12000rpm離心10 min ；
5)將步驟4)得到的離心液，取上清，并加入吸取的上清液體積1.5倍的-20°C預(yù)冷的異丙醇，在冰浴條件下放置30 min ；
6)將步驟5)中得到的冰浴后的混合液，在4°C、12000rpm離心10 min，棄上清，沉淀用-20°C預(yù)冷的75 %乙醇漂洗一次；
7)將步驟6)得到的漂洗后溶液，在4°C、5000rpm離心3 min,棄上清，在超凈工作臺上，將離心管倒置在無菌濾紙上吸干管壁內(nèi)液體后，在超凈臺上風(fēng)干2min ;
8)在步驟7)得到的風(fēng)干后離心管中，加DEPC-H2O50 μ I溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0007]本發(fā)明所用主要試劑的配制:
①1.0M Tris-HCl:稱取12.1g Tris堿溶于80 ml DEPC水中，用4.2 ml鹽酸濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為8.0，用DEPC水定容至100 ml，滅菌備用。
[0008]②5M KAc溶液:稱取49.07g醋酸鉀固體，加入40 ml DEPC水充分溶解后，加入5ml冰乙酸調(diào)節(jié)pH為5.8，用DEPC水定容至100 ml。
[0009]③0.5M EDTA 溶液:稱取 18.61g Na2-EDTA.2H20，加 80 ml DEPC 水充分溶解后，加入約3.3g NaOH顆粒調(diào)節(jié)pH為8.0，用DEPC水定容至100 ml，滅菌備用。
[0010]④2%CTAB 提取液:稱取 2g CTAB 固體，加入 1ml 1.0M Tris_HCl、5ml 0.5MEDTAU 1.7g NaCl，充分溶解后用DEPC水定容至100ml，滅菌后使用。
[0011]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的葡萄枝條RNA的提取方法，是利用CTAB對葡萄細胞裂解效果好的特點，從抑制提取過程中組多酚物質(zhì)的氧化褐變、利用2- 丁氧乙醇除去多糖等方面著手，建立的葡萄枝條RNA的高效提取方法，此方法獲得了高質(zhì)量的RNA，可以滿足葡萄SSH分析、轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學(xué)分析等對RNA質(zhì)量的要求。
[0012]經(jīng)本發(fā)明提取方法提取的RNA，具有以下優(yōu)點:
①經(jīng)過紫外分光光度法檢測表明，所提取RNA的A260 /A280在2.0左右，說明RNA的純度較高。
[0013]②1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖1所示)，28S rRNA和18S rRNA的條帶清晰，且28S亮度明顯高于18S，說明用該方法提取的總RNA無降解、質(zhì)量高。
[0014]③用TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit商品試劑盒，不能從葡萄枝條組織中提取到RNA (如圖1所示)。
【附圖說明】
[0015]圖1為米用本發(fā)明提供的RNA提取方法后進彳丁電泳檢測和米用TIANGENRNAsimple Total RNA Kit商品試劑盒進行RNA提取后進行電泳檢測的結(jié)果對比圖。
[0016]其中，試驗材料為紅地球葡萄莖段木質(zhì)部和形成層混合樣，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶1、條帶2為本發(fā)明提供的方法提取RNA電泳圖，條帶3、條帶4為用TIANGENRNAsimple Total RNA Kit商品試劑盒提取，可以看出，采用商品試劑盒不能從葡萄枝條組織中提取到RNA。
【具體實施方式】
[0017]實施例1:
葡萄枝條RNA的提取方法，包括以下步驟:
1)稱取0.2g葡萄韌皮部與形成層混合樣置入研缽中，加入聚乙烯吡咯烷酮固體粉末
0.02 g后，迅速倒入液氮進行充分研磨，然后將粉末轉(zhuǎn)入2 ml離心管中，加入預(yù)熱至65°C的2 % CTAB提取液700 μ I和20°C的β -巰基乙醇20 μ 1，顛倒混勻后，在65°C金屬浴30min，每隔5 min取出渦旋混勻I次；
2)取出步驟I)得到的渦旋混勻后的離心管放在冰上，迅速加入5M醋酸鉀溶液300μ I和2- 丁氧乙醇300 μ 1，渦旋振蕩，混勻后在-20 °C條件下靜置30min ;
3)在步驟2)得到的靜置后離心管中，加入200μ I CHCl3，4°C、15000rpm離心10 min ； 4)將步驟3)得到的離心液，取上清，加入800μ I CHCl3,4°C、12000rpm離心10 min ；
5)將步驟4)得到的離心液，取上清，并加入吸取的上清液體積1.5倍的-20°C預(yù)冷的異丙醇，在冰浴條件下放置30 min ；
6)將步驟5)中得到的冰浴后的混合液，在4°C、12000rpm離心10 min，棄上清，沉淀用-20°C預(yù)冷的75 %乙醇漂洗一次；
7)將步驟6)得到的漂洗后溶液，在4°C、5000rpm離心3 min,棄上清，在超凈工作臺上，將離心管倒置在無菌濾紙上吸干管壁內(nèi)液體后，在超凈臺上風(fēng)干2min ;
8)在步驟7)得到的風(fēng)干后離心管中，加DEPC-H2O50 μ I溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0018]如圖1所示，用TIANGEN RNAsimple Total RNA Kit商品試劑盒，不能從葡萄枝條組織中提取到RNA。
[0019]本發(fā)明技術(shù)要點:
1、對生長期幼嫩的葡萄枝條，可以直接用刀片刮取韌皮部和形成層提取RNA;對成熟的枝條或休眠期采集的枝條，先用刀片去掉已經(jīng)死亡的外皮層，然后再刮取呈綠色的韌皮部組織。
[0020]2、由于葡萄組織結(jié)構(gòu)的特殊性，很多植物核酸提取的裂解液不能有效的裂解釋放核酸，導(dǎo)致不能有效的提取葡萄組織中的RNA，這也是很多商品試劑盒不能提取葡萄RNA的主要原因。本方法采用CTAB能很好的裂解葡萄枝條組織細胞，但要嚴(yán)格控制裂解的溫度和時間。溫度過高或時間過長都會導(dǎo)致RNA的降解。
[0021]3、葡萄枝條含有大量的多糖，采用在冰上迅速加入5M KAc溶液300 μ I和2_ 丁氧乙醇300 μ 1，渦旋振蕩，混勻后在-20 °C條件下靜置30 min，對于去除多糖具有很好的作用。
[0022]最后應(yīng)說明的是:以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.葡萄枝條RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟:.1)稱取0.2g葡萄韌皮部與形成層混合樣置入研缽中，加入聚乙烯吡咯烷酮固體粉末.0.02 g后，迅速倒入液氮進行充分研磨，然后將粉末轉(zhuǎn)入2 ml離心管中，加入預(yù)熱至65°C的2 % CTAB提取液700 μ I和20°C的β -巰基乙醇20 μ 1，顛倒混勻后，在65°C金屬浴.30min，每隔5 min取出渦旋混勻I次； . 2)取出步驟I)得到的渦旋混勻后的離心管放在冰上，迅速加入5M醋酸鉀溶液300μ I和2- 丁氧乙醇300 μ 1，渦旋振蕩，混勻后在-20 °C條件下靜置30min ;.3)在步驟2)得到的靜置后離心管中，加入200μ I CHCl3，4°C、15000rpm離心10 min ；.4)將步驟3)得到的離心液，取上清，加入800μ I CHCl3,4°C、12000rpm離心10 min ； .5)將步驟4)得到的離心液，取上清，并加入吸取的上清液體積1.5倍的-20°C預(yù)冷的異丙醇，在冰浴條件下放置30 min ； .6)將步驟5)中得到的冰浴后的混合液，在4°C、12000rpm離心10 min，棄上清，沉淀用-20°C預(yù)冷的75 %乙醇漂洗一次； .7)將步驟6)得到的漂洗后溶液，在4°C、5000rpm離心3 min,棄上清，在超凈工作臺上，將離心管倒置在無菌濾紙上吸干管壁內(nèi)液體后，在超凈臺上風(fēng)干2min ;.8)在步驟7)得到的風(fēng)干后離心管中，加DEPC-H2O50 μ I溶解，_80°C保存?zhèn)溆谩?br>【專利摘要】本發(fā)明公開了葡萄枝條RNA的提取方法，包括以下步驟：稱取樣品加入聚乙烯吡咯烷酮以液氮研磨，加入CTAB提取液和β-巰基乙醇，金屬浴后混勻；混勻后放在冰上加入醋酸鉀溶液和2-丁氧乙醇，混勻靜置；再加入CHCl3離心；離心液取上清加入CHCl3，再次離心；離心液取上清，加入預(yù)冷的異丙醇，冰浴條件下放置30min；離心后棄上清，沉淀用預(yù)冷75%乙醇漂洗一次；離心后棄上清，將離心管風(fēng)干；再加DEPC-H2O溶解即可。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的葡萄枝條RNA的提取方法，獲得了高質(zhì)量的RNA，可以滿足葡萄SSH分析、轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學(xué)分析等對RNA質(zhì)量的要求。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104805075
【申請?zhí)枴緾N201510214755
【發(fā)明人】毛娟, 陳佰鴻, 申鵬, 馬宗桓, 米寶琴
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月30日