一種制備低分子量γ-聚谷氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備低分子量Y -聚谷氨酸的方法，屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種由微生物合成的高分子氨基酸聚合物。其對(duì)環(huán)境無(wú)污染，為綠色生物產(chǎn)品，具有極佳的生物可降解性、成膜性、成纖維性、可塑性、粘結(jié)性、保濕性等許多獨(dú)特的理化和生物學(xué)特性。在注重環(huán)保、強(qiáng)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的今天，這種由生物合成的可降解型功能材料受到人們的青睞，正逐漸地被應(yīng)用于醫(yī)藥制造，食品加工，蔬菜、水果、海產(chǎn)品的防凍、保鮮，也可開(kāi)發(fā)應(yīng)用于化妝品工業(yè)，煙草、皮革制造業(yè)及植物種子保護(hù)等許多領(lǐng)域，是一種有極大開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊前景的多功能新型生物制品。
[0003]目前γ-PGA的生產(chǎn)公司比較少，且γ-PGA產(chǎn)品以高分子量級(jí)別居多。低分子量Y-PGA是通過(guò)微生物發(fā)酵得到的高粘度γ-聚谷氨酸發(fā)酵液經(jīng)過(guò)后期降解得到的。低分子量γ-PGA可用作新型的藥物載體，實(shí)驗(yàn)表明，γ-PGA用作藥物載體的最佳分子量范圍是2萬(wàn)?6萬(wàn)，其分子量小，體積小，活潑基團(tuán)比例大，易與藥物結(jié)合，形成較穩(wěn)定的復(fù)合物。低分子量γ-PGA具有維持和增強(qiáng)HA(透明質(zhì)酸)的功能。HA是一種人體皮膚結(jié)構(gòu)的成分，保持皮膚的水潤(rùn)和彈性；實(shí)驗(yàn)證明，低分子量γ-PGA能高效抑制透明質(zhì)酸酶的活性，而且能大大提高HA在透明質(zhì)酸酶面前的穩(wěn)定性，從而減緩皮膚里HA的損失。低分子量γ-PGA能提高天然保濕因子水平。天然保濕因子(NFM)是皮膚產(chǎn)生的吸濕物質(zhì)，可提供位于皮膚最外層的角質(zhì)層的保濕功能，研宄報(bào)告顯示，在人類TESTSKIN培養(yǎng)基皮膚，低分子量γ -PGA在低至0.1 %的使用量時(shí)可以提高皮膚內(nèi)在的數(shù)種NMF的水平達(dá)95 %，皮膚NMF水平的持續(xù)增加可促進(jìn)皮膚的保水性。除此之外，低分子量γ-PGA還具有增強(qiáng)表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性、改善皮膚水分和彈性、減少表皮水分丟失及減緩免疫反應(yīng)等功能。
[0004]由于低分子量γ -PGA制備工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，尤其是分離純化和精制工藝方面對(duì)于大規(guī)?；a(chǎn)有障礙，且國(guó)內(nèi)眾多研發(fā)機(jī)構(gòu)及企業(yè)在這方面經(jīng)驗(yàn)不足，研發(fā)投入不夠，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不高，生產(chǎn)能力十分有限，也限制了 γ -PGA的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)市場(chǎng)上Y-PGA產(chǎn)品以高分子量級(jí)別居多，產(chǎn)品類型較少的狀況，本發(fā)明的目的是提供一種制備低分子量γ-聚谷氨酸的方法，分離提純得到高純度的低分子量γ-PGA產(chǎn)品，豐富γ-PGA產(chǎn)品類型，擴(kuò)大γ-PGA的應(yīng)用市場(chǎng)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種制備低分子量γ -聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007](I)發(fā)酵液制備:以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772 為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，得到發(fā)酵液；
[0008](2)高溫酸降解得低分量γ-聚谷氨酸:調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.5?4.0，溫度75?100°C，保溫降解4-8h，此過(guò)程將發(fā)酵液中100KDa以上的γ -聚谷氨酸降解為分子量范圍為10KDa-500KDa的低分子量γ-聚谷氨酸；待溫度降至降溫至0_60°C，加入活性炭脫色0-2h，脫色結(jié)束后，板框過(guò)濾，除菌體、活性炭及雜蛋白，得澄清無(wú)色料液；
[0009](3)沉淀析出:料液用鹽酸調(diào)pH至1.5-3.0，靜置12-24h，析出沉淀，板框過(guò)濾得白色粉末，并用PH1.5-3.0的純化水洗至廢水無(wú)色澄清為止；
[0010](4)沉淀重溶:將經(jīng)步驟(3)處理得到的白色粉末加入純化水，并調(diào)PH4.5-6.5，攪拌溶解，得到濃度為40%以上的溶液；
[0011](5)帶式干燥:將經(jīng)步驟(4)處理得到的高濃度水溶液經(jīng)過(guò)帶式干燥、粉碎得到低分子量Y _聚谷氨酸成品。
[0012]進(jìn)一步的，所述步驟⑴中發(fā)酵液的制備方法，其步驟如下:
[0013]a.種子培養(yǎng)
[0014]將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于35?37.5°C, 180?220r/min搖床震蕩培養(yǎng)16_32h，得到種子液；
[0015]b.發(fā)酵培養(yǎng)
[0016]將步驟(I)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2?3% (質(zhì)量比)，于35?37.5°C通氣攪拌培養(yǎng)45?50h，得發(fā)酵液。
[0017]各培養(yǎng)基成分如下:種子培養(yǎng)基:葡萄糖5?10g/L，酵母提取物3?5g/L，硫酸銨2?10g/L，谷氨酸鈉5?10g/L，硫酸鎂0.2?2g/L，pH 7.2?7.5，115°C滅菌20min ；發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖、葡萄糖、甘油、檸檬酸中任一種或至少兩種的混合物30?150g/L，蛋白胨5?30g/L，酵母提取物5?30g/L，硫酸銨5?20g/L，谷氨酸鈉30?100g/L，硫酸鎂0.2 ?2g/L，磷酸氫二鉀 2 ?10g/L，pH 7.2 ?7.5，121°C滅菌 20min。
[0018]上述發(fā)酵過(guò)程也可以采用本申請(qǐng)人自己的發(fā)明專利中的方法；該專利的申請(qǐng)?zhí)?201210555304.5 ;申請(qǐng)日:2012.11.02 ;發(fā)明名稱:一株產(chǎn)γ -聚谷氨酸基因工程菌及其高產(chǎn)rT _聚谷氨酸方法(見(jiàn)權(quán)利要求6及實(shí)施例5-6)。
[0019]進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，活性炭用量為發(fā)酵液重量的1%?2%，室溫?cái)嚢?0 ?90mino
[0020]進(jìn)一步的，所述步驟(5)帶式干燥工藝條件為:加熱區(qū)溫度為75?95°C，進(jìn)樣速度為20?30L/h，履帶速度為20?30cm/min。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:
[0022](I)本發(fā)明中的高溫、酸降解過(guò)程將100KDa以上的高分子量γ-PGA降解為10KDa-500KDa的低分子量γ-PGA，豐富了 γ-PGA產(chǎn)品類型，擴(kuò)大了 γ-PGA的應(yīng)用市場(chǎng)；
[0023](2)本發(fā)明利用在低pH值的澄清液中只有Y-聚谷氨酸沉淀析出的特性，達(dá)到了分離純化高純度低分子量γ-聚谷氨酸的目的。酸析出沉淀代替醇沉工藝，不僅提高了產(chǎn)品回收率，降低了工業(yè)成本和危險(xiǎn)性，還節(jié)省了能源；
[0024](3)本發(fā)明制備的低分子量γ-PGA收率達(dá)到85%以上，純度達(dá)到95%以上，提高了產(chǎn)品質(zhì)量。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1:
[0026](I)發(fā)酵液制備:將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)FRD518CGMCC N0.6772 進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液，具體步驟包括:
[0027]a.取冰箱內(nèi)_20°C條件下甘油保藏的菌種I支，接種環(huán)接一環(huán)種子于裝有10ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于35?37.5°C，200r/min搖床震蕩培養(yǎng)24h，得到種子液，菌種濃度達(dá)到OD600L 5?2.0 ;
[0028]b.將備好的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2.5%，于35?37.5°C通氣攪拌培養(yǎng)48h，得發(fā)酵液，發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)67g/l。
[0029]種子培養(yǎng)基:葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，硫酸錢(qián)5g/L，谷氨酸鈉10g/L，硫酸鎂 lg/L，pH 7.2 ?7.5，115°C滅菌 20min ；
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基:鹿糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，硫酸錢(qián)5g/L，谷氨酸鈉50g/L，硫酸鎂 lg/L，磷酸氫二鉀 10g/L，pH 7.2 ?7.5，121°C滅菌 20min。
[0031](2)低分量γ -聚谷氨酸獲取:
[0032]調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至3.5，升溫至85°C，保溫4h，待溫度降至60°C，加入I %的活性炭脫色90min，脫色結(jié)束后，板框過(guò)濾，除菌體、活性炭及雜蛋白，得澄清無(wú)色料液；此過(guò)程將發(fā)