一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的諸葛菜轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的諸葛菜轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002]滿葛HOrychophragmus v1laceus (L.) 0.E.Schulz)為十字花科蕓笞族諸葛菜屬植物，種子含油量高達(dá)35.8%，富含對人體有利的亞油酸、油酸、棕櫚酸等，而對人體不利的亞麻酸、芥酸含量極低，是一種新型優(yōu)質(zhì)的油料植物，也是特種油料作物新品種創(chuàng)制、選育的優(yōu)良種源。諸葛菜野生在平原、山地與路旁。分布廣，適性強(qiáng)，栽培管理簡便，具有良好的開發(fā)利用前景。
[0003]當(dāng)前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速，并全面推動了育種技術(shù)的升級，已在特種油料作物新品種創(chuàng)制方面發(fā)揮了重要作用，如高芥酸工業(yè)用油料作物的創(chuàng)制中，在低芥酸油菜中轉(zhuǎn)入來自高芥酸油菜或西蒙得木的FAEl基因，可將芥酸含量明顯提高至51。/『53.8%。目前諸葛菜的原生質(zhì)體及子葉和下胚軸組織的轉(zhuǎn)基因體系已初步建立并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株(周翼明等，見參考文獻(xiàn))，但這些遺傳轉(zhuǎn)化體系在應(yīng)用上均較煩瑣和困難，因?yàn)閮烧叨家?jīng)過組織培養(yǎng)和植物再生過程，因而將受到很多因素的影響和培養(yǎng)條件的限制，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差、遺傳轉(zhuǎn)化成本高、周期長、工作量大、效率低。
[0004]近年來，在植物花期利用攜帶有外源基因質(zhì)粒農(nóng)桿菌懸浮液對植物的花器進(jìn)行噴霧接種，從而將外源DNA導(dǎo)入胚珠中直接獲得轉(zhuǎn)基因種子的花序噴霧轉(zhuǎn)基因法逐漸得到了應(yīng)用，對于那些大面積種植在田間或植株較大、花序不集中的植物，花器噴霧法是理想的轉(zhuǎn)基因方法，可望有更廣的應(yīng)用范圍。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴于植物組織培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程，避免了植物組織培養(yǎng)過程中可能會產(chǎn)生的對植物基因型的依賴和各種無法預(yù)測的體細(xì)胞變異對后代的不利影響，且轉(zhuǎn)化速度快，實(shí)驗(yàn)周期短，目前已成功應(yīng)用于十字花科白菜、蘿卜、擬南芥、鹽芥和甘藍(lán)型油菜中。
[0005]參考文獻(xiàn)
[I]周翼明，衛(wèi)志明.PEG法介導(dǎo)轉(zhuǎn)化諸葛菜下胚軸原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)基因植株.遺傳學(xué)報(bào)，1996，23(1): 69-76 ο
[0006][2]周翼明，衛(wèi)志明.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化諸葛萊獲得轉(zhuǎn)基因植株.植物生理學(xué)報(bào)，23(1): 21-28。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的諸葛菜轉(zhuǎn)基因方法，通過花器噴霧法，在活體條件下，將諸葛菜花序與農(nóng)桿菌接觸，完成遺傳細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并通過對后代的篩選，獲得轉(zhuǎn)化植株，解決了諸葛菜采用常規(guī)組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)周期長的問題。
[0008]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的諸葛菜轉(zhuǎn)基因方法，包括如下步驟:
(I)將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，其中表達(dá)載體帶有抗除草劑基因Bar ; (2)將步驟(I)中制備的農(nóng)桿菌用滲透培養(yǎng)基懸??；
(3)將步驟(2)中含有懸浮農(nóng)桿菌的滲透培養(yǎng)基噴灑于諸葛菜花序上；
(4)將步驟(3)中轉(zhuǎn)化后的植株采取單株收種，得到TO代種子，在培育過程中利用抗除草劑Basta篩選得到具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株。
[0009]其中步驟(I)中的表達(dá)載體可為PSK1015或pGPTV-BAR系列質(zhì)粒；農(nóng)桿菌為GV3101 ；
步驟(2)中的滲透培養(yǎng)基中含有表面活性劑和蔗糖，表面活性劑優(yōu)選Silwet L-77，最佳濃度為500~1000 μ 1/L，蔗糖最佳濃度為30~60g/L ；
步驟(3)中的諸葛菜花序?yàn)楫?dāng)諸葛菜的主枝和部分側(cè)枝現(xiàn)蕾并有幾朵小花開放時，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，只留下花蕾的花序。
[0010]步驟(3)中的滲透培養(yǎng)基噴灑過程每隔2~3天進(jìn)行一次，共重復(fù)3次，每次噴灑結(jié)束后用羊皮紙袋包扎。
[0011]步驟(4)中的抗除草劑Basta使用濃度為1: 800 (V/V)，每隔3~4天噴施一次，連續(xù)噴3~4次。
[0012]本發(fā)明提供的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的諸葛菜轉(zhuǎn)基因方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，轉(zhuǎn)化效率高，實(shí)驗(yàn)周期短，具有較大的實(shí)際應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0013]圖1是處于最佳轉(zhuǎn)化時期的諸葛菜植株照片。
[0014]圖2是質(zhì)粒圖譜
LB為T-DNA左邊界；bar為植物篩選標(biāo)記基因，具有除草劑草銨膦Basta抗性；RB為T-DNA 右邊界。A 圖:pSK1015 質(zhì)粒；B 圖:pGPTV_BAR 質(zhì)粒。
[0015]圖3是除草劑噴施之后抗性苗的PCR檢測結(jié)果圖4是除草劑噴施之后抗性苗的GUS染色結(jié)果其中中間一行3個管中的葉片經(jīng)⑶S染色后呈藍(lán)色。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。引物均由IDT公司合成，PCR試劑盒來自Takara公司，植物基因組DNA提取試劑盒(DNeasy miniprep kit)購自QIAGEN公司，Basta試劑購自AgroEvo USA公司，X-Gluc購自北京啟維益成科技有限公司。常規(guī)試劑購自Takara公司。實(shí)驗(yàn)中所用菌株為常用菌株。
[0017]實(shí)施例1:
(I)諸葛菜種植
將諸葛菜種子于2月20日播種于苗床育苗，苗床的土壤應(yīng)肥沃且濕潤，上蓋麥秸或塑料薄膜。大約一個月幼苗出齊后，適當(dāng)通風(fēng)，苗高3~4cm時逐漸撤除覆蓋物，使幼苗直接接受光照，苗高8~10cm時，選擇陰天或雨前移栽，行距20~30cm，株距10?15cm，栽后立即淋澆定根水。種植1000株諸葛菜，占地面積大約為50 Hf (圖1)。諸葛菜肥水管理按常規(guī)方法進(jìn)行，當(dāng)年4~5月開花。此時，選擇最佳時期進(jìn)行諸葛菜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0018](2)制備含抗除草劑Basta篩選標(biāo)記基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌菌株選用GV3101，表達(dá)載體pSK1015質(zhì)粒帶有抗除草劑基因Bar，其圖譜如圖2所示。圖中LB為T-DNA插入左邊界；bar為植物篩選標(biāo)記基因，具有Basta抗性；RB為T-DNA插入右邊界。
[0019](3)含有含抗除草劑Basta篩選標(biāo)記基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、懸浮
挑取甘油凍存的(I)中制備的農(nóng)桿菌，于含抗生素(利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L、羧芐青霉素50mg/L和慶大霉素25mg/L)的LB培養(yǎng)基平板上畫線，28°C黑暗培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種于15ml含抗生素(利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L、羧節(jié)青霉素50mg/L和慶大霉素25mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，28 V 200rpm搖過夜。吸取上述培養(yǎng)液接種于500ml同樣的LB液體培養(yǎng)基中28°C 200rpm搖過夜，直至OD6tltol=0.8。將上述農(nóng)桿菌懸浮液在6000rpm離心15min，沉淀后的懸浮液于配置好的滲透培養(yǎng)基中，稀釋到OD6citlnm=0.8，用于植物轉(zhuǎn)化。
[0020]滲透培養(yǎng)基組成成分:每IL體積去離子水中加入Silwet L-77 500_1000ul和蔗糖 50go
[0021](4)在活體條件下進(jìn)行花器噴霧法轉(zhuǎn)化
當(dāng)諸葛菜的主枝和部分側(cè)枝現(xiàn)蕾并有幾朵小花開放時，去除主花序和每個分枝花序已開放的花朵，只留下花蕾。
[0022]使用噴霧器，將步驟(2)中制備的懸浮于滲透培養(yǎng)基的農(nóng)桿菌菌液均勻地噴灑于供轉(zhuǎn)化植株花序上，農(nóng)桿菌菌液的噴灑量為每朵花100~400ul。噴灑后，花序立即用羊皮紙袋包扎。
[0023]同一花序連續(xù)噴霧3次，間隔時間為2~3天。
[0024](5)噴霧后植株的管理
浸染完后套上羊皮紙袋，在完成最后一次轉(zhuǎn)化的