一種翻譯控制腫瘤蛋白的單克隆抗體雜交瘤及其單克隆抗體與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體地涉及一種翻譯控制腫瘤蛋白的單克隆抗體雜交 瘤及其單克隆抗體與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌（colorectalcancer,CRC)是西方國家最常見的實(shí)體瘤，約占惡性腫瘤 死亡率的10%。在美國結(jié)直腸癌居惡性腫瘤死因的第二位，每年大約有52, 000例結(jié)直腸癌 患者死亡。近年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率也呈上升趨勢，居第五位惡性死因。肝臟是結(jié)直腸 癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移器官，結(jié)直腸癌患者在疾病過程約有一半會進(jìn)展為肝轉(zhuǎn)移，其中30% 的患者肝臟為惟一的轉(zhuǎn)移部位，15~35%的結(jié)直腸癌患者初診時發(fā)現(xiàn)同時性肝轉(zhuǎn)移，20~ 25%的患者隨后出現(xiàn)異時性肝轉(zhuǎn)移。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌常見死因，近一半以上患者會死于 肝轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者如果放棄治療則預(yù)后極差，中位生存時間為6~12個月，盡管 經(jīng)過全身化療，但肝轉(zhuǎn)移瘤無法切除患者的中位生存時間只有12~24個月，生存時間超過 5年者罕見，結(jié)直腸癌同時性或異時性肝轉(zhuǎn)移一直是困擾臨床醫(yī)生的難題，如何盡早發(fā)現(xiàn)結(jié) 直腸癌肝轉(zhuǎn)移，或在結(jié)直腸癌根治術(shù)后對于肝轉(zhuǎn)移危險度進(jìn)行評估，并指導(dǎo)術(shù)后治療是目 前面臨的重要挑戰(zhàn)。對結(jié)直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移發(fā)生危險進(jìn)行預(yù)測，有助于術(shù)后進(jìn)行有針對性 的輔助治療，從而提尚整體生存率。
[0003] 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是一復(fù)雜而連續(xù)的過程，首先癌細(xì)胞從原發(fā)癌灶脫離，降解胞外 基質(zhì)脫離原發(fā)灶進(jìn)入門靜脈，隨后通過信號傳導(dǎo)，在相關(guān)受體和因子的作用下到達(dá)肝臟，穿 出血管重新粘附，進(jìn)而在肝臟形成新生血管、再增殖，最終使肝轉(zhuǎn)移灶形成。在此過程中各 種粘附分子、血管新生因子、細(xì)胞外金屬基質(zhì)蛋白酶等都產(chǎn)生作用。目前臨床上用以檢測結(jié) 直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的方法主要是通過B超、CT，MR和DSA等影像學(xué)手段，但對肝轉(zhuǎn)移灶的檢查 率僅為50~90%，而且對直徑lcm以下的微小轉(zhuǎn)移灶，很難做出明確的診斷，術(shù)中探查雖也 可發(fā)現(xiàn)一些早期結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移病灶，但當(dāng)轉(zhuǎn)移病灶直徑小于4_時，探查發(fā)現(xiàn)率大為降 低。早期因臨床癥狀不典型，CEA，CA19-9等腫瘤標(biāo)志物又缺乏特異性，診斷相對困難。無 論是結(jié)直腸癌初次確診時即己發(fā)現(xiàn)的肝轉(zhuǎn)移，抑或根治術(shù)后再發(fā)生的肝轉(zhuǎn)移，確診時僅有 1/4~1/3的肝轉(zhuǎn)移灶局限于一葉肝臟，大多數(shù)已經(jīng)累及兩葉，并且為多發(fā)，難以手術(shù)切除。 因此，肝轉(zhuǎn)移癌的早期正確診斷對指導(dǎo)治療，改善預(yù)后非常重要。尋找有效且穩(wěn)定的早期診 斷結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物，將對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的臨床診斷和治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的 影響。
[0004] 翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)，又稱P21 (小鼠TCTP)、P23 (人TCTP)、Q23,是一類廣泛 存在于動物、植物及酵母中在序列上高度保守且有很高同源性的蛋白家族，人類TPT1基因 編碼的蛋白稱fortilin，是一類新的抗凋亡蛋白質(zhì)。最初認(rèn)為TCTP是一類生長相關(guān)蛋白， 近年的研宄提示TCTP具有非常重要的生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程和惡性轉(zhuǎn)移、 鈣結(jié)合蛋白、細(xì)胞外組胺釋放蛋白、抗凋亡及抗瘧疾作用等。TCTP能夠增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能 力，在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移病人血清中的含量顯著升高。檢測TCTP在血清中的表達(dá)量對于監(jiān)控結(jié) 直腸癌的轉(zhuǎn)移有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移檢測技術(shù)所存在的不能 及時正確診斷的缺陷，提供一種分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株， 所述細(xì)胞株可分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗人翻譯控制腫瘤蛋白單 克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第四個目的是提供含有上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的免疫 檢測試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予實(shí)現(xiàn)的： 一種分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株MQ-ANTI-TCTP-1，其分 類命名為人翻譯控制腫瘤蛋白（Hu-TCTP)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，所述細(xì)胞株于2014年 10月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9811，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。
[0010] 上述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法如下：取血清效價大于1 :104的BALB/c小鼠脾細(xì) 胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50%PEG-4000進(jìn)行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用重組表達(dá)的人翻譯控制腫瘤蛋白包被ELISA板進(jìn)行 ELISA篩選；經(jīng)過多次有限稀釋，最后獲得穩(wěn)定分泌抗人翻譯控制腫瘤蛋白的雜交瘤細(xì)胞 株。
[0011] 由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得的抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體；優(yōu)選地，所 述單克隆抗體為IgGl型，輕鏈均為K鏈。
[0012] 所述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的制備方法：應(yīng)用保藏編號為CGMCC No. 9811的雜交瘤細(xì)胞株以IX106/只的量注入石蠟預(yù)處理的8~10周齡的BALB/c雌性 小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察10~14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ProteinG SepharoseFastFlow純化單克隆抗體，并通過SepharoseS-200分子篩脫鹽，PBS洗脫，以 SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達(dá)到90%以上。
[0013] 上述任意一種抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體在制備腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用； 優(yōu)選地，所述腫瘤為結(jié)直腸癌。
[0014] 含有上述抗人翻譯控制腫瘤蛋白單克隆抗體的免疫檢測試劑盒，所述免疫檢測試 劑盒還含有標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為熒光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物或酶標(biāo)記物。
[0015] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能用于ELISA、化學(xué)發(fā)光、 western-blot、免疫熒光以及組織的免疫組織化學(xué)檢測的抗人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP) 單克隆抗體。
[0016] 本發(fā)明中人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)的氨基酸序列如SEQIDN0 :1所示。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 目前尚未有國產(chǎn)化的TCTP的抗體，國外有一些公司比如NovusBiologicals等有可以 檢測TCTP的抗體產(chǎn)品，盡管可以用于免疫組化、ELISA、Westernblot等實(shí)驗(yàn)，但是抗體的 價格通常較昂貴，此外，像Abeam抗體以多抗居多，雖然特異性尚可，但是效價較低，另外一 些公司的抗體產(chǎn)品，與重組表達(dá)蛋白結(jié)合效果尚可，但是與天然TCTP蛋白反應(yīng)效果不佳。 因此限制了該蛋白作為臨床靶標(biāo)驗(yàn)證及其功能的研宄進(jìn)展。
[0018] 本發(fā)明以重組人翻譯控制腫瘤蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的 陽性，并用此純化抗體對結(jié)直癌細(xì)胞SW480和Lovo進(jìn)行Western-blot證明該抗體可以識 別天然變性的人翻譯控制腫瘤蛋白。
[0019] 本發(fā)明將此純化抗體用于進(jìn)行結(jié)直癌細(xì)胞Lovo的免疫熒光染色以及肝癌組織的 免疫組化染色證明其能識別天然的人翻譯控制腫瘤蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗 體為進(jìn)一步研宄人人翻譯控制腫瘤蛋白的功能和開發(fā)人人翻譯控制腫瘤蛋白的臨床診斷 試劑奠定了基礎(chǔ)，為其作為腫瘤臨床診斷和治療靶標(biāo)的驗(yàn)證提供有力的工具。
[0020] 本發(fā)明的單克隆抗體其免疫原是原核重組表達(dá)人翻譯控制腫瘤蛋白全長蛋白，其 氨基酸序列為NP_003286. 1，全長172個氨基酸。與國外現(xiàn)有抗體相比，應(yīng)用成本較低，能夠 適用于ELISA，Westernblot、等各種蛋白檢測實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的抗體不僅能與變性蛋白結(jié)合， 還能與具有高級結(jié)構(gòu)的天然蛋白結(jié)合，從而能應(yīng)用于免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)。該抗體的 應(yīng)用將為人翻譯控制腫瘤蛋白功能研宄和其作為結(jié)直腸癌腫瘤肝轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的臨床標(biāo)本 驗(yàn)證工作提供支持。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明單抗A1亞型鑒定結(jié)果。
[0022] 圖2是本發(fā)明單抗A1對結(jié)直癌細(xì)胞SW480和Lovo免疫印跡的結(jié)果以及陰性對照 結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量為23kDa附近。
[0023] 圖3是本發(fā)明單抗A1對結(jié)直癌細(xì)胞SW480和Lovo免疫熒光染色的結(jié)果以及普通 光鏡下的對照結(jié)果（顯微鏡放大倍數(shù)200倍）。
[0024] 圖4是本發(fā)明單抗A1對肝癌組織免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果以及陰性對照結(jié)果 (顯微鏡放大倍數(shù)100倍）。
【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的思 路，而不用于限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
[0026] 實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株的制備 1、重組人翻譯控制腫瘤蛋白抗原制備：從結(jié)直腸癌細(xì)胞Lovo中調(diào)取TCTP基因構(gòu)建 原核重組表達(dá)載體pET22b(+)/TCTP，在大腸桿菌EscherichiacoliBL21中表達(dá)，利用Ni S印harose親和層析純化柱進(jìn)行純化，獲得純度達(dá)90%以上的重組人TCTP蛋白（TCTP蛋白 的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示）。
[0027] 其中，擴(kuò)增人翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP)基因的引物序列為： 上游引物：5'-GTCGGATCCATGATTATCTACCGG-3'（SEQIDN0:2); 下游引物：5'-TTGCGGCCGCTTAACAmTTCCAITTCTAAACCA-3'（SEQIDN0:3); 其中，上游引入BamHI內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引入NotI內(nèi)切酶位點(diǎn)。
[0028] 2、小鼠免疫：取純化的TCTP重組蛋白與250y1Bentonite佐劑混合，以 100yg/500y1的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，間隔三周以1100yg/500y1的量腹部 皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，從第三次免疫開始，每次免疫后的第二周尾靜脈采集小鼠血， 間接ELISA方法檢測血清效價達(dá)到1:50000以上后準(zhǔn)備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強(qiáng) 免疫一次，抗原劑量100yg。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均使用商品化產(chǎn)品。
[0029] 3、免疫血清效價測定：采用間接ELISA法測定免疫血清效價。取30ygTCTP重組 蛋白溶解于l〇ml0. 05MpH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C過 夜。次日，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，用10mMPBS含10%新生牛血 清封閉液200y1/孔，37°C封閉lh，使用PBS(含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗板三次，小鼠 于第三次免疫后15天尾靜脈采血，鼠免疫血清用含2 %新生牛血清10mMPBS以KL1~10 _8 倍稀釋，加入96孔板