用于核酸擴(kuò)增的羧基化聚苯乙烯微球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因組測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用于基因組測(cè)序核酸擴(kuò)增的羧基化 聚苯乙烯微球的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為上世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的發(fā)明之一，DNA測(cè)序技術(shù)深刻地改變了人們對(duì) 生命本質(zhì)的理解和掌控能力，極大地推動(dòng)了全球生命科學(xué)領(lǐng)域研宄的發(fā)展。假如沒(méi)有測(cè)序 技術(shù)，基因序列就無(wú)法確定，酶切、克隆、反轉(zhuǎn)錄、cDNA、PCR、SNP、RNAi等研宄技術(shù)也就根本 無(wú)從談起，生命科學(xué)領(lǐng)域不會(huì)有今日的蓬勃發(fā)展。生命科學(xué)領(lǐng)域無(wú)人不曉的GenBank，以及 歷時(shí)13年耗資3億美元的全球合作完成的人類基因組計(jì)劃，無(wú)不建立在測(cè)序的基礎(chǔ)上。
[0003] 自1977年Sanger發(fā)明了利用了 DNA聚合酶的雙脫氧終止原理測(cè)定核苷酸序列的 技術(shù)以來(lái)，測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，新方法相繼問(wèn)世，測(cè)序規(guī)模也不斷擴(kuò)大。測(cè)序技術(shù)的操作簡(jiǎn) 單化、成本低廉化、以及高通量化成為測(cè)序技術(shù)的發(fā)展方向。SOLiD，454以及Solexa等為代 表的新一代高通量測(cè)序技術(shù)，以三國(guó)鼎立的姿態(tài)平分著序列測(cè)定的天下。三種技術(shù)各有千 秋，發(fā)展更新的速度可謂日新月異。但目前而言，其測(cè)序文庫(kù)制備的過(guò)程均仍較為復(fù)雜。
[0004] 測(cè)序文庫(kù)的制備作為整個(gè)測(cè)序過(guò)程中的第一個(gè)且及其重要的一個(gè)步驟，對(duì)測(cè)序結(jié) 果的優(yōu)劣有著決定性的作用。測(cè)序文庫(kù)的制備大體來(lái)說(shuō)包括以下幾個(gè)步驟。第一步是如何 將核酸從待檢測(cè)的樣本中高質(zhì)量地提取出來(lái)。針對(duì)不同的樣本，人們所選用的實(shí)驗(yàn)流程和 方式將會(huì)有較大的差異；第二步是如何將長(zhǎng)片段的核酸進(jìn)行小片段花處理，主要針對(duì)基因 組DNA及長(zhǎng)片段的RNA等樣本，因?yàn)槟壳皽y(cè)序儀對(duì)于讀長(zhǎng)的限制，只能對(duì)制備的隨機(jī)小片段 進(jìn)行測(cè)序，再通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行拼接，得出全基因組的序列信息。目前核酸小片段化 基本使用物理作用來(lái)進(jìn)行，超聲波由于其自身的各種優(yōu)點(diǎn)而成為打碎DNA的普遍方式，可 通過(guò)調(diào)節(jié)超聲功率及超聲時(shí)間來(lái)獲得不同長(zhǎng)度的小片段DNA。第三步便是如何將小片段核 酸的兩端連接上測(cè)序所需的通用接頭序列；第四步是如何將連接有接頭序列的核酸序列進(jìn) 行單分子多拷貝擴(kuò)增，包括有乳液PCR、橋式PCR及滾環(huán)擴(kuò)增等，在擴(kuò)大測(cè)序信號(hào)強(qiáng)度的同 時(shí)確保真實(shí)的反映樣本的原始信息。而乳液PCR -般采用微球捕獲一個(gè)模板DNA到一個(gè)小 球，利用乳液PCR擴(kuò)增單一模板，將同一模板在一個(gè)微球上擴(kuò)增成上百萬(wàn)個(gè)模板克隆。
[0005] -般來(lái)講，在乳液PCR中采用的微球?yàn)榫郾揭蚁≒S)微球，并且在微球表面進(jìn)行 鏈霉親和素修飾，從而使其可以捕獲生物素標(biāo)記的DNA分子。目前，合成單分散PS微球的 方法有微乳液聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、懸浮聚合法和種子聚合法等。但現(xiàn)有的 合成方法都是交聯(lián)劑和單體混合后再進(jìn)行聚合，這種辦法合成的聚合物微球聚合物是整 體交聯(lián)的，往往球形度差，粒徑可控性低，因而通常需要分選才能達(dá)到粒徑分布偏差小于 5%的要求。為了合成得到交聯(lián)的微球，卻又不影響到微球的球形度和單分散性，日本專利 JP58-106554和JP63-191818雖然提出了種子聚合的方法，即先通過(guò)乳液聚合獲得種子，然 后進(jìn)行增長(zhǎng)，擴(kuò)大粒子。本方法的缺點(diǎn)是微球在生長(zhǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生次級(jí)粒子，需要篩分除去， 造成產(chǎn)品收率降低，操作復(fù)雜，經(jīng)濟(jì)性差。因此，要得到粒徑均一的微米級(jí)單分散具有交聯(lián) 的聚合物微球粒子是非常困難的。
[0006] 由于用于核酸擴(kuò)增的PS微球需要表面羧基化后才能和鏈霉親和素交聯(lián)，從而與 標(biāo)記有生物素的DNA模板連接，進(jìn)而進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增。因此，制備羧基含量高的PS微球 是至關(guān)重要的，目前，用聚合法制備羧基化聚苯乙烯微球時(shí)，均采用添加丙烯酸的方式向聚 苯乙烯微球表面引入羧基。但采用這種方法制備出的羧基化聚苯乙烯微球大部分羧基被包 埋在微球內(nèi)部，聚苯乙烯微球表面的羧基分布比例不高，一般為0. 25mmol/g。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種羧基化聚苯乙烯微球的制備方法，其制備的微球可 用于基因組測(cè)序文庫(kù)制備中的核酸擴(kuò)增，所述微球粒徑為25微米，具體步驟如下：
[0008] (1)將分散劑加入反應(yīng)介質(zhì)中，通入氮?dú)?；攪拌至均相體系；
[0009] (2)將苯乙烯單體和引發(fā)劑加入反應(yīng)體系中；將反應(yīng)體系升溫；然后在攪拌條件 下進(jìn)行恒溫反應(yīng)；冷卻至室溫、洗滌、干燥，即得聚苯乙烯微球；
[0010] ⑶取另一容器病加入鄰苯二甲酸酐（PA)粉末及一定量的溶劑，超聲振蕩lOmin， 然后加入聚苯乙烯微球，向反應(yīng)瓶中通純氮一段時(shí)間后，在攪拌狀態(tài)下加入三氯化鋁，再通 純氮3min后60°C下反應(yīng)6小時(shí)。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)介質(zhì)選自水、乙醇、乙二醇單甲醚和甲醇的 一種或者兩種以上的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)介質(zhì)為水和乙二醇單甲醚， 其中，水和乙二醇單甲醚的重量百分比為10~90%和10~90% ;也可以為20~40%和 60~80%，優(yōu)選為23%和77%。
[0012] 所述的分散劑為磷酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇和羥丙 基纖維素中的一種或者兩種以上的任意組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分散劑由聚乙 烯醇、羥丙基纖維素和聚乙二醇組成，聚乙烯醇、羥丙基纖維素和聚乙二醇的重量百分比為 10~80%、10~80%和10~80% ;也可以為20~40%、30~50%和20~50%，優(yōu)選為 25%、35%和 40%。
[0013] 引發(fā)劑選自偶氮二異丁腈（AIBN)或者過(guò)氧化苯甲酰（BP0)的一種或兩種的任意 比例組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈。
[0014] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，在最終的反應(yīng)體系中，苯乙烯單體、分散劑、引發(fā)劑 和反應(yīng)介質(zhì)的重量百分比依次為5~40%的苯乙烯單體，0. 1~1%的分散劑，0.025~ 0. 125%的引發(fā)劑，反應(yīng)介質(zhì)余量；優(yōu)選為32%的苯乙烯單體，0. 3%的分散劑，0. 05%的引 發(fā)劑，反應(yīng)介質(zhì)余量。
[0015] 在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，所述步驟（2)將反應(yīng)體系升溫至10-90°C，優(yōu)選為 75°C ;攪拌速度控制在80~120轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選為100轉(zhuǎn)/分鐘。
[0016]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟（3)，所述溶劑由硝基苯和二氯甲烷組成，硝 基苯和二氯甲烷的體積比為1:7 ;聚苯乙烯微球、鄰苯二甲酸酐和三氯化鋁的重量比為1 : 0. 02 ：0. 05〇
[0017] 在基因組測(cè)序中，用于DNA文庫(kù)中核酸擴(kuò)增的PS微球的粒徑一般為25微米，并且 要求單分散性好。但在PS微球制備方法中，分散聚合法制備的PS微球單分散性好，但微 球的粒徑較小，種子聚合法和懸浮聚合法雖然制備的PS微球粒徑較大，但微球的單分散性 差，分散系數(shù)高。因此在本領(lǐng)域中，制備粒徑為20至50微米的單分散PS微球一直存在著 上述問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)大量試驗(yàn)摸索并且意外發(fā)現(xiàn)，在一種特定的反應(yīng)條件下，采用分散聚 合法成功制備出單分散PS微球，粒徑為25微米并且分散系數(shù)低。另外，通過(guò)傅克反應(yīng)，并 且對(duì)反應(yīng)體系的催化劑、試劑和溶劑的用量進(jìn)行了合理優(yōu)化，所制備出的羧基化聚苯乙烯 微球的羧基擔(dān)載量為2. Ommol/g以上。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將進(jìn)一步的舉例說(shuō)明本發(fā)明。需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求 保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附 權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0019] 實(shí)施例1聚苯乙烯微球的制備
[0020] 向反應(yīng)容器中加入230g的水、770g的乙二醇單甲醚、1. lg的聚乙烯醇、1. 54g的羥 丙基纖維素和1. 76g的聚乙二醇，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，并在室溫下攪拌20分鐘至均相體系，然后 加入苯乙烯單體473g和偶氮二異丁腈0. 73g。升溫至75°C，恒溫反應(yīng)8小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束， 冷卻至室溫，產(chǎn)品離心，并用乙醇反復(fù)洗滌，干燥，即得單分散PS微球。
[0021] 實(shí)施例2聚苯乙烯微球的制備
[0022] 向反應(yīng)容器中加入230g的水、770g的乙二醇單甲醚、1. 0g的聚乙烯醇、1. 59g的羥 丙基纖維素和1.81g的聚乙二醇，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)，并在室溫下攪拌20分鐘至均相體系，然后 加入苯乙稀單體473g和偶氮二異丁腈0. 81g。升溫至7