基于檢測(cè)外周血線粒體dna氧化損傷評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了檢測(cè)外周血線粒體DNA 氧化損傷的試劑在制備評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的試劑中的應(yīng)用，以及基于檢測(cè)外周血線粒體 DNA氧化損傷評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氧化應(yīng)激，指機(jī)體活性氧（reactive oxygen species，R0S)或活性氮（reactive nitrogen species，RNS)產(chǎn)生過(guò)多和/或機(jī)體抗氧化能力減弱，R0S或RNS清除不足，導(dǎo)致 體內(nèi)R0S或RNS增多，破壞了機(jī)體的氧化/還原的正常失衡，從而導(dǎo)致組織和細(xì)胞發(fā)生氧化 損傷的病理過(guò)程。因此，評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激在疾病診斷和相關(guān)科學(xué)研宄中（如氧化應(yīng)激與 衰老、神經(jīng)退行性變、代謝性疾病等的相關(guān)研宄）均有重要意義。
[0003] 目前，對(duì)于氧化應(yīng)激水平的評(píng)價(jià)體系主要包括檢測(cè)以下生物分子：1)活性氧/ 活性氮修飾的生物分子：包括蛋白質(zhì)氧化損傷標(biāo)志物，如蛋白質(zhì)羰基化、硝基化損傷、晚 期氧化蛋白產(chǎn)物（A0PP);脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，如4-羥基壬烯醛（HNE)和丙二醛（MDA)，以 及核酸氧化損傷時(shí)產(chǎn)生的8_0HdG;2)抗氧化酶活性，如超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷脫甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶酶（glutathione S-transferase，GST)和血紅素 氧化酶（heme oxygenase，H0)等。目前常用檢測(cè)方法主要包括，1)用分光光度法檢測(cè)MDA、 S0D、CAT、還原型/氧化型GSH、GPx等，方法簡(jiǎn)單，且相對(duì)便宜，但穩(wěn)定性差；2)利用ELISA 檢測(cè)MDA、HNE、8-OHdG等，該法比較可靠，費(fèi)用相對(duì)較高。此外，利用高效液相色譜-電化學(xué) (HPLC-ECD)法、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS)等可用于8-OHdG水平的檢測(cè)，但由于需要相關(guān)儀器，且操 作繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)，難于推廣和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 在對(duì)外周血的分子診斷研宄中，認(rèn)為外周血循環(huán)的核酸成分可成為反映疾 病狀態(tài)較好的指標(biāo)。外周血包括血漿和血細(xì)胞（紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì) 胞、血小板等）。外周血中淋巴細(xì)胞的基因組DNA的氧化損傷，如8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷 (8-hydroxydeoxygumlosine，8-〇HdG)/ 8_羥基鳥(niǎo)嗓呤（8-〇x〇-guanine，8_ox〇-G)的產(chǎn) 生或者DNA鏈的斷裂，已被應(yīng)用于評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激狀態(tài)。與核基因組DNA相似，線粒體 DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)也存在類(lèi)似的損傷。
[0005] mtDNA位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，為環(huán)狀雙鏈、多拷貝的DNA。人類(lèi)完整的mtDNA為閉合 環(huán)狀雙鏈DNA，長(zhǎng)16569bp，編碼37個(gè)基因。線粒體獨(dú)立存在于細(xì)胞核外的細(xì)胞器，是細(xì)胞 能量和R0S產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。由于mtDNA暴露于高活性R0S環(huán)境中，且缺乏組蛋白保護(hù)和 有效的修復(fù)機(jī)制，mtDNA更易遭受氧化攻擊而產(chǎn)生氧化損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致DNA突變，其突變 率為核DNA的20倍。本專(zhuān)利基于mtDNA易氧化損傷的特點(diǎn)，通過(guò)分析細(xì)胞內(nèi)、外mtDNA損 傷水平來(lái)更靈敏的反映氧化應(yīng)激狀態(tài)，并將該方法應(yīng)用于代謝綜合征患者和健康對(duì)照外周 血單個(gè)核細(xì)胞、血漿mtDNA氧化損傷水平的檢測(cè)。
[0006] 首先利用 8_ 氧化鳥(niǎo)嗓呤 DNA 糖基化酶（human oxoguanine glycosylase 1， hOGGl)在體外酶解DNA，該酶在體內(nèi)為參與DNA堿基切除修復(fù)的關(guān)鍵酶，能特異性識(shí)別并切 除DNA雙鏈中8-OHdG，產(chǎn)生脫嘌呤（AP)位點(diǎn)，進(jìn)而經(jīng)堿基切除修復(fù)機(jī)制恢復(fù)正常G:C堿基 配對(duì)。在體外，hOGGl酶去除DNA分子上的8-OHdG后，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，利用熒光定量PCR特 異性擴(kuò)增mtDNA。由于mtDNA分子經(jīng)hOGGl酶切后產(chǎn)生缺堿基位點(diǎn)，與未酶切的mtDNA存在 擴(kuò)增的差異，結(jié)果上表現(xiàn)為Ct的差異，Ct差值（A Ct值）即反映mtDNA氧化損傷水平。
[0007] 在專(zhuān)利的效果評(píng)價(jià)中，利用不同濃度H202建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，用線粒體靶向 性抗氧化劑Mitoquinone (MitoQ)構(gòu)建抗氧化細(xì)胞模型。H202作用細(xì)胞引起氧化應(yīng)激是較為 常用的方法，本專(zhuān)利使用中低濃度（50-200 yM)H202。MitoQ是一種親脂性的帶正電荷的醌 醇類(lèi)物質(zhì)，可穿過(guò)細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層直接進(jìn)入帶負(fù)電荷的線粒體，降低線粒體R0S的產(chǎn)生， 抑制線粒體膜電位的下降以及細(xì)胞色素C的釋放，具有線粒體保護(hù)作用
[0008] 一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑在制備評(píng)價(jià)體內(nèi)氧 化應(yīng)激的試劑中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步地，其中所述檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑為PCR引物和人8-氧 化鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶（hOGGl)。
[0010] 再進(jìn)一步地，其中PCR引物為選自下列引物對(duì)的引物對(duì)：
[0011]DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)；
[0012] C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)；
[0013]ND1：正向弓丨物 CCTAATGCTTACCGAACGAA (SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
[0014] 進(jìn)一步地，選擇PCR引物：
[0015] DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)〇
[0016]另一方面，本發(fā)明提供了基于檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng) 激的非診斷方法，步驟包括：
[0017] (1)提取樣本 DNA;
[0018] (2)使用hOGGl處理部分DNA ;
[0019] (3)使用hOGGl處理過(guò)和未處理過(guò)的DNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)；
[0020] (4)比較hOGGl處理過(guò)和未處理過(guò)的DNA的Ct值差異；
[0021] (5)根據(jù)Ct值差異，判斷8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OH-dG)的含量，并間接反映DNA氧 化損傷和體內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。
[0022] 進(jìn)一步地，其中步驟（3)的qPCR反應(yīng)中使用的引物選自下列引物對(duì)：
[0023]DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)；
[0024]C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)；
[0025] ND1 ：正向弓丨物 CCTAATGCTTACCGAACGAA (SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
[0026] 再進(jìn)一步地，其中步驟（3)的qPCR反應(yīng)中使用的引物為：DLP1:正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID N0.1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTAITTA(SEQ ID N0.2)。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1 :熒光顯微鏡觀察氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激細(xì)胞模型DCFH-DA熒光強(qiáng)度。
[0028] 圖2 :流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)R0S水平。
[0029] 圖3 :不同H202濃度下的細(xì)胞MDA含量和S0D活力。
[0030] 圖4 :氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激細(xì)胞模型CAT、GSH-S、S0D活力和MDA含量。
[0031] 圖5: ACt值計(jì)算圖示。
[0032] 圖6 :各對(duì)引物的擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0033] 圖7 :qPCR擴(kuò)增結(jié)果（DLP1引物為例，上為擴(kuò)增曲線，下為溶解曲線）
[0034] 圖8 :各對(duì)引物擴(kuò)增后的A Ct值。
[0035] 圖9 :利用DLP1檢測(cè)氧化應(yīng)激和抗氧化細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清mtDNA氧化損傷水平。
[0036] 圖10 :代謝綜合征患者和健康對(duì)照血清MDA含量比較。
[0037] 圖11 :外周血PBMC mtDNA與血漿游離mtDNA氧化損傷水平比較
【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)
[0039] 根據(jù)NCBI基因庫(kù)人類(lèi)mtDNA(NC_012920)標(biāo)準(zhǔn)序列，首先針對(duì)mtDNA D-loop區(qū) (displacement loop)設(shè)計(jì)引物。D-loop區(qū)包含mtDNA重鏈合成的復(fù)制起始區(qū)，是mtDNA 復(fù)制的控制區(qū)，也是mtDNA與線粒體膜的結(jié)合位點(diǎn)，易受脂質(zhì)過(guò)氧化物的影響，是mtDNA 突變的高發(fā)區(qū)，堿基突變率比其他區(qū)域高6-8倍。D-loop區(qū)包括三個(gè)高變區(qū)，高變區(qū) I (npl6024-16383)、高變區(qū)II (np57-372)和高變區(qū)III (np438-574)。因此，為保證擴(kuò)增的 特異性，在設(shè)計(jì)引物時(shí)避開(kāi)這三個(gè)高變區(qū)。
[0040] 表1中顯示的DLP1引物擴(kuò)增的片段，未涵蓋高變區(qū)，而DLP2引物擴(kuò)增片段則部分 包含了高變區(qū)。此外，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增C0X1基因、C0X2基因和ND1基因的引物，以進(jìn)行比較，這 些區(qū)域在mtDNA中相對(duì)保守且不易缺失。
[0041] 表1用于mtDNA氧化損傷檢測(cè)的引物列表
[0042]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑在制備評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的試劑中的應(yīng)用。
2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑為PCR引 物和人8-氧化鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶（hOGGl)。
3. 權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中PCR引物為選自下列引物對(duì)的引物對(duì)： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)； C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)； NDl :正向引物 CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中PCR引物為： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)〇
5. 基于檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的非診斷方法，步驟包 括： (1)提取樣本DNA ; ⑵使用hOGGl處理部分DNA ; (3) 使用hOGGl處理過(guò)和未處理過(guò)的DNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)； (4) 比較hOGGl處理過(guò)和未處理過(guò)的DNA的Ct值差異； (5) 根據(jù)Ct值差異，判斷8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OH-dG)的含量，并間接反映DNA氧化損 傷和體內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。
6. 權(quán)利要求5所述的非診斷方法，其中步驟（3)的qPCR反應(yīng)中使用的引物為選自下列 引物對(duì)的引物對(duì)： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)； C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)； NDl :正向引物 CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
7. 權(quán)利要求6所述的非診斷方法，其中步驟（3)的qPCR反應(yīng)中使用的引物為：DLP1 : 正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA (SEQ ID NO. 2) 〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑在制備評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的試劑中的應(yīng)用，以及基于檢測(cè)外周血線粒體DNA氧化損傷評(píng)價(jià)體內(nèi)氧化應(yīng)激的方法。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104846075
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510145466
【發(fā)明人】葉薇, 劉楚, 湯曉君, 呂建新
【申請(qǐng)人】溫州醫(yī)科大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月31日