專利名稱：C₆₀的多羥基衍生物在防治線粒體損傷相關(guān)疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及C6。的多羥基衍生物 在防治線粒體損傷相關(guān)疾病中的用途。
背景技術(shù)：
線粒體是廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，具有環(huán)狀DNA，可以進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制的 特殊的細(xì)胞器。它不僅是機(jī)體消耗氧和產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所，還具有多種其它 極為重要的生理功能，包括產(chǎn)生超氧陰離子等活性氧、調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原電勢(shì) 和信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞調(diào)亡和基因表達(dá)等。作為細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)和信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò) 的調(diào)控中心，線粒體因在生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進(jìn)化 等多個(gè)方面表現(xiàn)出的重要作用，日益受到人們的關(guān)注。研究表明，人類許多疾 病，如衰老及與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，腫瘤、2型糖尿病都伴有不同程 度的線粒體功能障礙。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的主要細(xì)胞器，活性氧是反 應(yīng)活性極強(qiáng)的代謝衍生分子，包括超氧自由基('02—)、過(guò)氧化氫(HA)和羥基 自由基(* 0H—);其過(guò)量產(chǎn)生能破壞細(xì)胞系統(tǒng)中的氧化物和抗氧化物之間的動(dòng)態(tài) 平衡，導(dǎo)致線粒體本身的退行性病變和脂類分子的過(guò)氧化、DNA和蛋白修飾異 常與細(xì)胞功能損傷。為此，如何抑制和修復(fù)線粒體損傷將為線粒體相關(guān)性疾病 的預(yù)防和治療提供新的藥物靶點(diǎn)。老年性震顫麻痹，即帕金森氏癥(Parkinson' s Disease, PD)是危及老年 人健康的第二大類神經(jīng)退行性疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)PD的發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng) 不斷增高，我國(guó)的PD患病率在30 60歲為500/10萬(wàn)，60歲以上為1000/10 萬(wàn)，男女比例為l:l，與其它國(guó)家類似。PD的一個(gè)重要特征是中腦黑質(zhì)致密部 多巴胺能神經(jīng)元的退行性死亡，這將導(dǎo)致紋狀體中多巴胺匱乏，產(chǎn)生靜止性震 顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)反射障礙為特征的運(yùn)動(dòng)控制失調(diào)癥狀，此外還常 伴有認(rèn)知失調(diào)。PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且有待闡明，線粒體氧化損傷導(dǎo)致的線粒體
退行性病變，被認(rèn)為是引起與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)主要因素而受 到普遍關(guān)注。線粒體(特別是損傷線粒體)是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的主要細(xì)胞器， 線粒體結(jié)構(gòu)受損以及酶活性降低反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步加重線粒體損傷，導(dǎo)致細(xì)胞能 量代謝障礙、細(xì)胞功能喪失。例如PD病人紋狀體的電子傳遞鏈中線粒體復(fù)合 物I有嚴(yán)重缺陷，在動(dòng)物和人身上能導(dǎo)致類似PD癥狀的藥物1-甲基-4-苯基 -l，2,3,6-四氫吡啶，以魚(yú)藤酮和6-羥多巴，其主要作用都是抑制線粒體復(fù)合 酶I。到目前為止，還沒(méi)有任何藥物和療法從根本上阻止或延緩帕金森綜合癥 的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)現(xiàn)有藥物還都有嚴(yán)重的副作用。線粒體DNA(mitchondrial DNA， mtDNA)是裸露的雙鏈環(huán)狀DNA分子結(jié)構(gòu)， 其缺少組蛋白外衣的保護(hù)，復(fù)制快速。缺乏校讀功能以及缺乏有效的DNA修復(fù) 系統(tǒng)，極易發(fā)生突變。而電離輻射作為一種致DNA損傷的因素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它可 以誘導(dǎo)線粒體DNA的突變，其中包括缺失、點(diǎn)突變、插入突變等。在凋亡調(diào)節(jié) 諸多通路中，線粒體在電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中起中心調(diào)控作用。各種 死亡信號(hào)通過(guò)Bcl-2家族蛋白或直接誘導(dǎo)線粒體膜的通透性的改變、細(xì)胞色素 C釋放和caspases激活，最終引起細(xì)胞凋亡。輻射病是短期暴露于大量地射線或長(zhǎng)期暴露于小量的射線引起的疾病。例 如腫瘤病患者放療后可引起輻射病，放療時(shí)在超短時(shí)間內(nèi)可產(chǎn)生大量的自由 基，耗盡體內(nèi)的輻射防護(hù)系統(tǒng)超氧岐化酶的防御和破壞細(xì)胞活性物質(zhì)線粒體、 高爾基體、核糖核酸和脫氧核糖核酸等、產(chǎn)生諸如骨髓抑制，免疫抑制，胃腸 道功能障礙等。多年來(lái)放療專家一直在尋求解決放射線毒副作用的方法，利用 高氧和低氧放療，使用放射增敏劑和保護(hù)劑，但收效都不大。因此，本領(lǐng)域迫切需要找到對(duì)于線粒體相關(guān)性疾病如帕金森、輻射病等疾病 有效的藥物。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供C6。或其多羥基衍生物在防治線粒體損傷相關(guān)疾病 中的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種式I所示化合物或由多種式I所示化合物 形成的混合物的用途，C60 (OH) n I，
其中，n為0-24的正整數(shù)；所述的化合物或混合物用于制備防治線粒體損傷相關(guān)疾病的組合物。在另一優(yōu)選例中，n為16-24的正整數(shù)。正整數(shù)n越大，該化合物的溶解 度越高。在另一優(yōu)選例中，所述的線粒體損傷相關(guān)疾病選自 神經(jīng)退行性疾病、輻射病、2型糖尿病。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)退行性疾病選自帕金森氏癥、老年癡呆。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于改善免疫功能。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于提高細(xì)胞活性；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位；提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平；防止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷；防止細(xì)胞內(nèi)DNA損傷；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體傳遞鏈復(fù)合酶的活性；提高細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)；和/或降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；清除細(xì)胞內(nèi)自由基。在另一優(yōu)選例中，所述的線粒體傳遞鏈復(fù)合酶選自線粒體傳遞鏈復(fù)合酶 I、線粒體傳遞鏈復(fù)合酶II。在另一優(yōu)選例中，所述的自由基選自超氧自由基、羥基自由基、禾Q/或脂質(zhì)自由基。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞選自(但不限于)神經(jīng)上皮細(xì)胞、脾臟細(xì)胞 或肝臟細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于 降低哺乳動(dòng)物肝臟線粒體活性氧水平； 促進(jìn)哺乳動(dòng)物脾細(xì)胞增殖；和/或 提高哺乳動(dòng)物脾臟細(xì)胞線粒體膜電位。在本發(fā)明的第二方面，提供一種體外(優(yōu)選非治療性地)防止細(xì)胞線粒體 損傷方法，所述方法包括給予細(xì)胞有效量的式I所示化合物或由多種式I所示化合物形成的混合物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易 見(jiàn)的。


圖1顯示順磁共振波譜儀檢測(cè)C6。(OH)24體外吸收自由基的效應(yīng)。圖1A為C6。(0H)24對(duì)于超氧自由基的清除作用； 圖1B為C6。(0H)24對(duì)于羥基自由基的清除作用； 圖1C為對(duì)于脂質(zhì)自由基的清除作用。圖2顯示Ce。(0H)24能有效的保護(hù)細(xì)胞免受MPP+造成的細(xì)胞活性的下降。 **p〈0. 01，同對(duì)照組(不加入C6"0H)"和MPP+)相比較;#p<0, 05和糾p〈0. 01， 同MPP+組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。圖3顯示C6。(0H)24能有效的保護(hù)MPP+造成的線粒體膜電位的下降jp〈0. 05， 同對(duì)照組相比較；#p<0.05，同MPP+組相比較，—p<0. 01，同Cs。(OH)M組相比較， 多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。圖4顯示C6。(0H)24能有效的保護(hù)MPP+造成的細(xì)胞內(nèi)古谷胱甘肽水平的降低。 林p〈0, 01，同對(duì)照組相比較；##p〈0. 01，同MPP+組相比較，—p〈0. 01，同C6。(0H)24 相比較。多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。圖5顯示U(0H)24能有效的保護(hù)MPP+引起的蛋白質(zhì)的氧化損傷。圖中上面顯 示的蛋白質(zhì)氧化后形成羰基蛋白的水平，下圖為考馬斯亮藍(lán)染色顯示的總蛋白 水平。圖6顯示C6。(0H)24能有效保護(hù)MPP+引起的DNA氧化損傷。其中，第1列顯示 的是TRITC的染色，紅色表示特異性的8-0X0-dG水平，第2列顯示的MPI染 色，DAPI使整個(gè)細(xì)胞核染成蘭色；第3列是第l列和第2列的合并。圖7顯示C6。(0H)24能有效的保護(hù)MPP+造成的DNA損傷。
圖7A是單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；圖7B是圖7A的量化；其中，**p<0.01，同對(duì)照組相比較；糾p〈0.01，同MPP+組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。圖8顯示C6。(0H) 24能有效的保護(hù)MPF引起的線粒體復(fù)合酶I (圖8A)和II (圖 8B)的活性的降低。**p〈0. 01，同MPP+組相比較；,<0. 01， #p〈0, 05，同MPP+ 組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。圖9顯示U(0H)24能有效的保護(hù)MPP+引起Nrf2蛋白表達(dá)的降低。圖中顯示 的是三次實(shí)驗(yàn)有代表的結(jié)果。圖10顯示C6。(0H)24能有效的保護(hù)MPP+引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的提高。 **p〈0. 01，同對(duì)照組相比較；#p<0.05，同MPP+組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。圖11顯示C6。(0H)M能有效保護(hù)輻射引起小鼠肝臟線粒體活性氧升高。 **p<0. 01，同正常組相比較；##p<0.01，同輻照組相比較。圖12顯示Ce。(0H)24能有效提高輻射引起小鼠脾細(xì)胞增殖率降低。*p<0.05， 同正常組相比較；#p〈0.05，同輻照組相比較。圖13顯示C6。(0H)24能有效保護(hù)輻射引起小鼠脾臟細(xì)胞線粒體膜電位的降低。 **p〈0. 01，同正常組相比較；##p<0.01，同輻照組相比較。圖14顯示了各種處理組小鼠體內(nèi)MDA含量情況。**p<0.01，同對(duì)照組(正 常小鼠，注射生理鹽水不輻照)相比較；弁pO.05和弁弁p0.01，同輻照組相比較， 每組的ICR小鼠為8只(11=8)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次揭示Ce。及其多羥基衍生物對(duì)于線粒 體損傷相關(guān)疾病的防治具有極其顯著的效果。本發(fā)明人分別采用帕金森氏綜合
癥的細(xì)胞模型和輻射病的動(dòng)物模型，從線粒體形態(tài)學(xué)，線粒體復(fù)合物酶活性， 細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)生化指標(biāo)，核酸、蛋白、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等方面，充分論證了 U及其多羥基衍生物對(duì)于防治線粒體損傷的優(yōu)異功效，從而為開(kāi)發(fā)以線粒體為 靶點(diǎn)的多功能藥物提供了有效途徑。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。C6。及其多羥基衍生物C6。(又稱為富勒烯)是碳的第三種同位素異型體，其是由60個(gè)碳原子組成 的具有特殊的中空籠狀結(jié)構(gòu)的球形分子，包括12個(gè)五元環(huán)和20個(gè)六元環(huán)，有 30個(gè)雙鍵，其直徑約為O. 71nm。C6。的多羥基衍生物又稱富勒醇。C6。的多羥基衍生物由于含有一定數(shù)量的羥 基而更易溶于水，而且羥基的數(shù)量越多水溶性越好。因此，所述的C6?；蚱涠嗔u基衍生物具有如式I所示的結(jié)構(gòu)C60 (OH) n I， 其中，n表示0-24的正整數(shù)。已有的研究表明，C。?？梢园l(fā)生Diels-Alder反應(yīng)、Bingel反應(yīng)和1， 3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，能清除自由基。但是其對(duì)線粒體的作用至今還沒(méi)有被人們意 識(shí)到。而本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，"及其多羥基衍生物對(duì)于線粒體損傷的防治具 有極其優(yōu)異的效果。所述的U或其多羥基衍生物的制備方法可采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)人員所了 解的方法，比如化學(xué)合成的方法，所述的化合物可以以純凈物的形式用于本發(fā)明，例如化合物Ce。或化合物Ce。 (OH) 24;此外，由兩種或多種所述的化合物組成的混合物也可用于本發(fā)明，例 如，U和C6。 (OH) 24的組合；或者含有多種C6。的多羥基衍生物的混合物，如混 合物中含有C6。 (OH) 24、 C6。 (OH) 23、 C6。 (OH) 22等。此外，考慮到化合物的溶解 性，優(yōu)選的是那些羥基數(shù)量較多的化合物，例如n為16-24的C6。多羥基衍生物。本發(fā)明的化合物還可以以藥學(xué)或生理學(xué)上可接受的鹽或酯的形式使用。這些 鹽或酯包括(但不限于)與如下酸形成的鹽或酯氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬 酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來(lái)酸、 草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸。鹵化物的鹽同樣適用。其他 鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以其他常規(guī) 的"前體藥物"形式存在的鹽(當(dāng)以這種形式給藥時(shí)，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性部分)。用途本發(fā)明提供了 C6?；蚱涠嗔u基衍生物在修復(fù)線粒體損傷方面的作用，從而 可用于制備預(yù)防或治療線粒體損傷相關(guān)疾病的藥物。所述的線粒體損傷相關(guān)疾 病例如如帕金森氏綜合癥和輻射病。本發(fā)明人利用l-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)建立了模擬急性環(huán)境毒性導(dǎo) 致的神經(jīng)退行性疾病(帕金森氏綜合癥)的體外細(xì)胞模型。構(gòu)建細(xì)胞模型基于的 原理為MPP+可直接被多巴胺能神經(jīng)元膜上的單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取進(jìn)入胞內(nèi)，然后 進(jìn)入線粒體，特異性地與線粒體傳遞鏈復(fù)合酶I結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)一步抑 制ATP合成，并且產(chǎn)生大量自由基和醌類物質(zhì)，導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元發(fā)生退行性 改變，甚至死亡。本發(fā)明人應(yīng)用MPP+急性處理人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)為表達(dá)線粒體傳 遞鏈復(fù)合酶I活性的下降。然后觀察應(yīng)用不同濃度的C6。或其多羥基衍生物進(jìn)行 預(yù)防性干預(yù)的效應(yīng)。本發(fā)明人還考察了 U或其多羥基衍生物對(duì)于該線粒體損傷 模型中線粒體功能的各項(xiàng)指標(biāo)的影響，針對(duì)該細(xì)胞模型分別觀察線粒體酶活 性；線粒體中ROS高活性代謝分子的水平；線粒體的腫脹度和線粒體的膜電位以及蛋白、核酸及脂質(zhì)氧化損傷水平。本發(fā)明人還考察了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性 及其參與抗氧化酶活性調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。此外，本發(fā)明人還在整體動(dòng)物模型水平上研究了含U或其多羥基衍生物的生物效應(yīng)。采用Y射線輻照的方法使小鼠線粒體受到損傷，考察小鼠肝臟線粒 體中R0S高活性代謝分子的水平和線粒體的膜電位，以及考察小鼠脾臟淋巴細(xì) 胞的增殖率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C6?；蚱涠嗔u基衍生物對(duì)于神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞和小鼠肝臟線粒體的 氧化損傷有很好的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)充分證明，C6?；蚱涠嗔u基衍生物保護(hù)細(xì)胞免 受MPP+造成的DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化、線粒體功能的下降、細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的破壞；Ce?；蚱涠嗔u基衍生物保護(hù)輻射引起的肝臟線粒體的活性氧和膜電位 的下降，并保護(hù)輻射引起的脾臟細(xì)胞增殖降低，提高了小鼠的免疫力。并揭示 了 Ce。或其多羥基衍生物的良好的吸收自由基的效應(yīng)和通過(guò)激活Nrf2的通路，促 進(jìn)細(xì)胞GSH的生成，保護(hù)線粒體功能和抵抗氧化損傷的機(jī)制。組合物如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的組合物"包括藥物組合物和飲食補(bǔ)充劑(如 保健品組合物)，只要它們含有u或其多羥基衍生物作為對(duì)于修復(fù)線粒體損傷有用的活性成分。通常，所述的藥物組合物或飲食補(bǔ)充劑含有0.000001-20wt。/。(優(yōu)選的為 0. 00005-10wt%;更優(yōu)選0.00001-5wt。/。)的C6?；蚱涠嗔u基衍生物；(b)藥學(xué)上或 食品學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明中，"藥學(xué)上可接受的"成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副 反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。本發(fā)明中， "藥學(xué)上可接受的載體"是用于將本發(fā)明的C6。或其多羥基衍生物傳送給動(dòng)物或 人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑等。載體可以是液體形式 或固體形式。本發(fā)明所述的組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有 效地到達(dá)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自(但不限于)片劑、膠 囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、或懸浮液。其中U或其多羥基衍生物可以存在 于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。一些增加可C6?；蚱涠嗔u基衍生物溶解 性的物質(zhì)也可應(yīng)用于本發(fā)明的組合物中。從易于制備和給藥的立場(chǎng)看，優(yōu)選的組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固 體填充或液體填充的膠囊。組合物的口服給藥是優(yōu)選的。所用的活性成分的有效劑量可隨所用的化合物、給藥的模式或待治療的疾病 的嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的C6?；蚱涠嗔u基衍生物每天以約 0. l-100mg/kg動(dòng)物體重的劑量給予時(shí)，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以 l-3次分開(kāi)的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天 的總劑量約為O. l-1000mg，較佳地約為l-500mg。適用于內(nèi)服的劑量形式，包含 與固態(tài)或液態(tài)藥學(xué)上可接受的載體密切混合的約1-200mg的活性化合物?？烧{(diào)節(jié) 此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若 干次分開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少或增加。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于 Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉 的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本 發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法1. 試劑地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤；抗PGC-lci抗體購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司；抗微管蛋白(tubulin)抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；TRIzol購(gòu) 于美國(guó)Invitrogen公司；抗復(fù)合物I, II， III的抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購(gòu)于美國(guó)Proraega公司；游離脂肪酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自南 京建成生物試劑公司；熱啟動(dòng)Taq酶購(gòu)于日本TaKaRa公司；D-loop, PPAR-a , L-CPT1， NRF1; mtTFA和18SRNA引物由上海博亞公司合成；硫辛酰胺購(gòu)自于 Fluka公司，N-乙酰半胱氨酸購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司；實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定 試劑盒購(gòu)自大連寶生物(Takara Bio)公司;p-JNK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；小鼠月中瘤壞死因子a (Tumor necrosis factor—a ， TNF—a ) 購(gòu)自美國(guó)R&D公司；2-脫氧-D-[1-3H]葡萄糖(2-D0G)購(gòu)自英國(guó)Amersham公 司；BCA蛋白測(cè)定試盒和West Pico chemilurainescent發(fā)光底物來(lái)自美國(guó) PIERCE公司；R-硫辛酸(簡(jiǎn)稱硫辛酸)由德國(guó)K. Wessel博士贈(zèng)送(或也可商購(gòu)， 如可購(gòu)自上海新嵩巍有限公司)；其余的細(xì)胞培養(yǎng)的試劑均購(gòu)自于美國(guó) Invitrogen公司。2. 方法細(xì)胞培養(yǎng)和脂肪細(xì)胞分化3T3-L1前脂肪細(xì)胞(購(gòu)自ATCC， Cat. No. CL-173)用完全培養(yǎng)液(DMEM+10% 胎牛血清+青、鏈霉素各100u/ml)，在37。C孵箱(5。/。二氧化碳，95%空氣)中培 養(yǎng)，每2天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至完全融合后2天(第0天)，開(kāi)始誘導(dǎo)分化， 具體步驟為將培養(yǎng)液換成含0.5raM IBMX、 0.25 p M地塞米松和1 yM胰島 素的完全培養(yǎng)液；48h后，撤去IBMX和地塞米松，使完全培養(yǎng)液中只含有l(wèi) UM 胰島素；2天后換液，撤去胰島素，使用不含有任何誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基；以
所述的順磁共振波譜儀由德國(guó)Brucker光譜儀公司生產(chǎn)。檢測(cè)的自由基主要包 括常見(jiàn)的超氧自由基、羥基自由基以及脂質(zhì)自由基。次黃嘌啉和次黃嘌啉氧化 酶產(chǎn)生超氧自由基；羥基自由基由Fenton反應(yīng)產(chǎn)生；脂質(zhì)自由基由SDS-CuS04 系統(tǒng)產(chǎn)生。制備不同濃度的C6。(0H)24水溶液，依次用ESR檢測(cè)相關(guān)自由基的信 號(hào)強(qiáng)度。分別采用DMPO(二甲基吡咯氧酮)和POBN(a -(1氧基-4_吡啶基-N-叔 丁基氮氧化合物)作為自由基捕獲劑。圖1顯示C6。(0H)"體外吸收自由基的效應(yīng)。電子自旋共振(ESR)結(jié)果顯示 C6。(0H)24能很好的清除三種常見(jiàn)的自由基超氧自由基、羥基自由基和脂質(zhì)自 由基。其中清除超氧自由基的IC50(半數(shù)清除率)為36. 8uM(圖1A);清除羥基 自由基的IC50為135.4uM(圖1B);清除脂質(zhì)自由基的IC50為495 uM(圖1C)。上述結(jié)果可見(jiàn)，U(OH)m清除超氧自由基的能力和SOD差不多；清除羥基自 由基的能力是甘露醇的268倍；清除脂質(zhì)自由基的能力是維生素E的37倍。 因此，C6。(0H)24具有極其優(yōu)異的體外吸收自由基效應(yīng)。實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)、C6。(0H)24和MPP+對(duì)SK-N-MC細(xì)胞的處理1. 細(xì)胞培養(yǎng)SK-N-MC細(xì)胞(成人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞，ATCC)，培養(yǎng)在37。C， 5°/。二氧化碳飽和 濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為a -MEM,加入10%FBS， 0. 5mM丙酮酸鈉，0. 2徹a跳， 100U/L青霉素和100mg/L硫酸鏈霉素。2. C6。多羥基衍生物的合成合成Ce。(0H)24，采用的方法是將C6。和液溴反應(yīng)，加入少量還原性Fe粉作 為催化劑，反應(yīng)時(shí)間為48小時(shí)，反應(yīng)得到產(chǎn)物為C6。Br24。再將得到的Ce。Br24 與PH=13的NaOH水解反應(yīng)2小時(shí)，經(jīng)過(guò)提純得到C6。(0H)^。提純方法如下水 解后產(chǎn)物用80%的乙醇洗五次，再將合成的C6。(0H)m水溶液裝入透析袋中用 MilliQ純水進(jìn)行透析，直到透析液PH〈6. 5，真空干燥后做質(zhì)譜表征，發(fā)現(xiàn)分 子離子峰1128。高分辨質(zhì)譜顯示其分子式為C6。(OH)24，其純度大于95%。使用前放入4t:保存。此外，通過(guò)減少Ce。和液溴反應(yīng)的時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間約30小時(shí))，還制備了C6。(0H)24和/或羥基數(shù)量少于24的其它C6。多羥基衍生物的混合物。 3.分組和處理在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，C6。(0H)24在SK-N-MC細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為50uM。 MPP+ 在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為500iiM。實(shí)驗(yàn)分為四組，分別是正常對(duì)照組(不加入C6。(0H)M和MPP+)、 C6。(0H)24組、 MPP+損傷組、預(yù)先加C6。(0H)24組再加MPP+組(合并組)。其中預(yù)先加C6。(0H)24的時(shí)間為48小時(shí)。實(shí)施例3 C6。(0H)24對(duì)細(xì)胞活性的影響本實(shí)施例中，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性。 細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，按如實(shí)施例2所述方法分組和處理后，加入50ul 5mg/mlMTT，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育3個(gè)小時(shí)后，棄去MTT，加入200ulDMS0 溶解紫色產(chǎn)物，于酶標(biāo)儀(Molecular Device, Spectra Max 340)讀取560nm 吸光值。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，單加入MPP+24小時(shí)后，細(xì)胞活性下降至對(duì)照 的45%，而預(yù)先加入不同濃度的C6。(0H)24，高于20tiM的Ce。(OH)24開(kāi)始有明顯的 保護(hù)效果，其中50u M的C6。(0H)"保護(hù)效果基本和正常對(duì)照組差不多。 林p〈0. 01，同對(duì)照組相比較；#p〈0. 05和將p〈0. 01，同MPP+組相比較，多于三 次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。上述結(jié)果可見(jiàn)，Ce。(OH)24能有效地保護(hù)細(xì)胞免受MPP+造成的細(xì)胞活性的下降，提高細(xì)胞的活性。實(shí)施例4 C6。(0H)24對(duì)線粒體膜電位的影響本實(shí)施例中，線粒體膜電位檢測(cè)方法如下SK-N-MC細(xì)胞培養(yǎng)在96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，按如實(shí)施例2所述的處理方法處理后，加入含20"M JC-l染料的 培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育30分鐘，棄去含染料的培養(yǎng)基，每孔用200y 1PBS 洗一次，再加入200y 1PBS于熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，檢測(cè)發(fā)射波 長(zhǎng)530nm和590nm，熒光強(qiáng)度比值(590nm/530nm，紅光比綠光)，作為線粒體膜 電位的指標(biāo)。結(jié)果如圖3所示，不加入MPP+而僅加入C6。(0H)24，可顯著地提高線粒體的膜 電位；加入MPP+ 24小時(shí)后，線粒體的膜電位下降，而預(yù)先加入C6。(0H)2,保護(hù) 的細(xì)胞的線粒體的膜電位顯著高于MPP+處理組，能較大程度的提高線粒體膜電
位。C6。(0H)M組的線粒體膜電位顯著高于正常對(duì)照組。*p<0. 05，同對(duì)照組相比較；#p<0.05，同MPP+組相比較；—p<0.01,同Ce。(0H)24組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。因此可見(jiàn)，Ce。(0H)24能有效地提高線粒體膜電位，并且能夠有效地保護(hù)^ ^+造成的線粒體膜電位的下降。實(shí)施例5 Ce。(0H)24對(duì)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的影響還原型谷胱甘肽含量的測(cè)定方法如下細(xì)胞培養(yǎng)在100mm細(xì)胞培養(yǎng)板中，按 如實(shí)施例2所述的處理方法處理后，用PBS洗一次，用生理鹽水刮下細(xì)胞，用 玻璃勻漿器手動(dòng)研磨20次，3000rcf、 4。C離心10分鐘，取上清，按照試劑盒 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行GSH含量測(cè)定，該試劑盒的原理為二硫代二硝基苯甲酸和巰基化合 物反應(yīng)產(chǎn)生一種黃色化合物，從而進(jìn)行比色測(cè)定。圖4顯示，不加入MPP+而僅加入"。(0H)24，可顯著地提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水 平；加入MPP+ 24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平顯著降低，而預(yù)先加入"。(0H)24 保護(hù)的細(xì)胞谷胱甘肽水平顯著高于MPP+處理組。C6。(0H)M組的谷胱甘肽水平顯 著高于正常對(duì)照組。**p<0.01，同對(duì)照組相比較；ft#p<0.01，同MPP+組相比較， 一p〈0.01，同U(OH)M相比較。多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。因此可見(jiàn)，Ce。(0H)24能有效地提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平，并且能夠有效地保護(hù)MPP+造成的細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平的降低。實(shí)施例6 C6。(0H)24對(duì)蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用氧化性蛋白檢測(cè)方法如下細(xì)胞培養(yǎng)在100mm細(xì)胞培養(yǎng)板中，按如實(shí)施例2 所述的處理方法處理后，用PBS洗一次，細(xì)胞用含lmM的細(xì)胞裂解液收取蛋白 后，按照Oxyblot Protein Oxidation Detection Kit說(shuō)明進(jìn)行，該試劑盒原 理為用2,4-二硝基苯基肼(Dinitrophenylhydrazine， DNPH)標(biāo)記氧化性蛋 白，以抗DNPH的抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，用考馬斯亮藍(lán)染色聚丙烯酰胺蛋白電泳凝膠，作為蛋白量的內(nèi)參。結(jié)果如圖5所示，加入MPP+24小時(shí)后，細(xì)胞氧化性蛋白水平比對(duì)照組顯著 升高，而預(yù)先加入U(xiǎn)(OH)M保護(hù)的細(xì)胞氧化性蛋白水平顯著降低，接近正常對(duì) 照組。圖中上面顯示的蛋白質(zhì)氧化后形成羰基蛋白的水平，下圖為考馬斯亮藍(lán) 染色顯示的總蛋白水平。 因此可見(jiàn)，Ce。(0H)24能夠有效地保護(hù)細(xì)胞，防止蛋白質(zhì)的氧化損傷。實(shí)施例7 C6。(OH)24對(duì)于DNA損傷的保護(hù)作用1. DNA的氧化損傷檢測(cè)檢測(cè)方法如下用抗8-oxo-dG抗體來(lái)檢測(cè)DNA的氧化損傷，8-oxo-dG是DNA 氧化損傷的標(biāo)志。細(xì)胞生長(zhǎng)在12誦的玻片上，C6。(0H)"及MPP+處理后用70%的 冷乙醇固定， 一抗用抗8-oxo-dG抗體(l: 300稀釋)，二抗用TRITC連接的IG 抗鼠抗體(l: 200稀釋)。用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察DNA的氧化損傷。結(jié)果如圖6所示，DNA的氧化損傷通過(guò)抗8-oxo-dG特異性抗體染色，再通 過(guò)激光共聚焦熒光顯微鏡觀察8-羥鳥(niǎo)苷水平。圖中，第1列顯示的是TRITC的 染色，紅色表示特異性的8-oxo-dG水平，第2列顯示的DAPI染色，DAPI使整 個(gè)細(xì)胞核染成蘭色；第3列是第1列和第2列的合并。從圖中可以看出，加入 MPP+24小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)DNA的氧化損傷顯著升高，而預(yù)先加入C6。(0H)24能顯著 降低MPP+引起的DNA的氧化損傷。由上述結(jié)果可見(jiàn)，C6。(0H)24能有效地防止DNA氧化損傷。2. 單細(xì)胞電泳實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按如實(shí)施例2所述的處理方法處理后，用 0. 25%的胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，均勻重懸于37。C的0. 75%低熔點(diǎn)瓊脂糖中，并 滴在載玻片上，用蓋玻片壓平，在4"C環(huán)境下，低熔點(diǎn)瓊脂糖形成凝膠后，將 玻片置于細(xì)胞裂解液中(2. 5MNaCl， 100mMEDTA， 10mM Tris pH10. 0， 1% Triton X-IOO和10% DMSO)，放置兩個(gè)小時(shí)，然后在電泳液(300mM NaOH， lmM EDTA) 中放置20分鐘，之后進(jìn)行電泳(300毫安，25伏特，20分鐘)，電泳后的玻片 浸入中和液(0.4M Tris， pH7.5)中和，取出后在凝膠上滴上PI (2 u g/ml)染細(xì) 胞核，于熒光顯微鏡下觀察，在紫外光激發(fā)下，觀察細(xì)胞核是否在電泳中出現(xiàn) 拖尾，數(shù)出總細(xì)胞中帶拖尾細(xì)胞的百分比，作為DNA損傷的指標(biāo)。結(jié)果如圖7A和圖7B所示，加入MPP+24小時(shí)后，細(xì)胞核損傷的(有拖尾的) 占總細(xì)胞數(shù)的90%以上，預(yù)先加入C6。(0H)24保護(hù)的細(xì)胞核損傷的(有拖尾的)占 總細(xì)胞數(shù)的18%。 **p<0.01，同對(duì)照組相比較；##p〈0.01，同MPP+組相比較， 多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。由上述結(jié)果可見(jiàn)，C6。(0HL能有效地防止DNA損傷。 實(shí)施例8 C6。(0H)M對(duì)于線粒體傳遞鏈復(fù)合酶的影響線粒體傳遞鏈復(fù)合酶I和線粒體傳遞鏈復(fù)合酶II活性的檢測(cè)方法如下細(xì)胞培養(yǎng)在100mra細(xì)胞培養(yǎng)板中，按如上方法處理后，用PBS洗一次，刮下細(xì)胞， 在低滲溶液中用玻璃勻漿器手動(dòng)研磨20次，800rcf、 4'C離心5分鐘，收取上 清，11000rcf、 4'C離心30分鐘，所得沉淀為線粒體，用于復(fù)合酶I和II的 活性測(cè)定。復(fù)合酶I的測(cè)定方法為在反應(yīng)液(50mM Tris pH8. 1， 0. 1%BSA, 1 u M Antimycin A， 0. 2mMNaN3， 0. 05mM CoQl， 0. 4mMDCPIP)中力口入終濃度為50 u g/ral 的線粒體，用終濃度為0. 2mM的NADH啟動(dòng)反應(yīng)，于600nm測(cè)定吸光度的降低 速度，以此作為活性的反映。復(fù)合酶II的測(cè)定方法為在反應(yīng)液(50mM磷酸鉀緩沖液，pH7. 8， 2mMEDTA， 0. 1%BSA， 3uM魚(yú)藤酮，1 w M Antimycin A， 0. 2mM NaN3， 0.05mMCoQl， 0. 2mM ATP， OJmM DCPIP)中加入終濃度為100" g/ml的線粒體，于600nm測(cè)定吸光 度的降低速度，以此作為活性的反應(yīng)。測(cè)定結(jié)果如圖8A和圖8B所示，加入MPP+24小時(shí)后，線粒體的復(fù)合酶I和 II的活性分別降低到對(duì)照組的48%和63%，而預(yù)先加入Ce。(0H)24保護(hù)的細(xì)胞的 線粒體復(fù)合酶I和II的活性顯著高于MPP+處理組。**p〈0.01，同MPP+組相比 較；共ttp〈0,01， #p<0. 05，同MPP+組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì)檢 驗(yàn)。由上述結(jié)果可見(jiàn)，U(OH)M能有效地防止線粒體復(fù)合酶I和II的活性的降低。實(shí)施例9 C6。(0H)24對(duì)于Nrf2蛋白表達(dá)的影響Nrf2的表達(dá)用蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)。檢測(cè)采用實(shí)施例2所述 的處理方法處理的細(xì)胞內(nèi)Nrf2的表達(dá)?？筃rf2的抗體來(lái)自Santa Cruz公司， 一抗?jié)舛葹?:1000， 二抗使用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體。結(jié)果如圖9所示，加入MPP+24小時(shí)后，Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯降低，而預(yù) 先加入C6。(0H)24能有效提高M(jìn)PP+引起的Nrf2蛋白表達(dá)水平。圖中顯示的是三次 實(shí)驗(yàn)有代表的結(jié)果。由上述結(jié)果可見(jiàn)，Ce。(0H)24能有效地防止Nrf2蛋白表達(dá)的降低。
實(shí)施例10 Ce。(OH)24對(duì)于細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測(cè)方法如下細(xì)胞培養(yǎng)在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按如上方法處理后，加入含25wM DCFH-DA(2，7二氯熒光素雙乙酸鹽)染料的培養(yǎng)基，在 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育30分鐘，棄去含染料的培養(yǎng)基，用冷的PBS洗三次，再制 成500uL細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀(FACSAriaTM， Becton Dickinson)檢測(cè)細(xì) 胞的熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm)，熒光值作為細(xì)胞內(nèi)活性氧的 高低的指標(biāo)。結(jié)果如圖10所示，加入^ ^+ 24小時(shí)后，細(xì)胞質(zhì)中活性氧水平有明顯的提 高，而預(yù)先加入U(xiǎn)(0H)2j呆護(hù)的細(xì)胞活性氧水平低于MPP+處理組。**p〈0. 01， 同對(duì)照組相比較；#p<0.05，同MPP+組相比較，多于三次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用于統(tǒng)計(jì) 檢驗(yàn)。由上述結(jié)果可見(jiàn)，U(OH)M能有效地防止細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的提高。實(shí)施例11 C6。(0H)24對(duì)于小鼠肝臟線粒體活性氧的影響本實(shí)施例中，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察線粒體活性氧變化，方法如下采用Y 射線輻照的方法使小鼠線粒體受到損傷，取出肝臟，采用差速離心的方法提取肝線粒體。正常組、給C6。(0H)M組、輻照組、合并組線粒體加入含丙酮酸鈉的DCra-DA溶液，37。C溫育30分鐘，棄去DCFH-DA溶液，用冷的PBS洗三次， 用熒光酶標(biāo)儀(Flex StationII 384， Molecular Devices)讀取熒光值(激 發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm) ， BCA方法測(cè)定蛋白濃度，單位濃度蛋白的熒 光值作為各組線粒體活性氧的高低的指標(biāo)。結(jié)果如圖ll所示，小鼠輻照后，肝臟線粒體活性氧水平明顯升高，而輻照 前給予Ce。(OH)24組其肝臟線粒體活性氧水平顯著降低，基本和正常組活性氧水 平差不多。**p<0.01，同正常組相比較；##p<0. 01，同輻照組相比較。由上述結(jié)果可見(jiàn)，"。(OH)w能夠有效地防止小鼠肝臟線粒體活性氧升高。實(shí)施例12 C6。(0H)M對(duì)于小鼠脾細(xì)胞增殖的影響本實(shí)施例中，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察脾臟細(xì)胞增殖，方法如下頸椎脫臼處死小鼠，于無(wú)菌條件下取出脾臟，在磷酸鹽緩沖液(PBS， pH值7.4)中勻漿過(guò) 濾，制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液。低滲液處理去除血細(xì)胞，PBS洗滌2次后，用含10%
胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為7. 5 X106個(gè)'mL—'。在96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中每孔加細(xì)胞懸液100uL，每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37 °C 、飽和濕 度為5% C02孵溫箱中培養(yǎng)48 h，然后每孔加20uL MTT(5 nig mL—')，繼續(xù)培 養(yǎng)4h。棄培養(yǎng)液，每孔加入DMS0 200u L，于酶標(biāo)儀(Molecular Device, Spectra Max 340)讀取560nm吸光值。結(jié)果如圖12所示，小鼠輻照后，脾臟細(xì)胞增殖率下降，而輻照前給予C6。(0H)M 組其脾臟細(xì)胞增殖率升高。*p<0.05，同正常組相比較；共p〈0.05，同輻照組相 比較。由上述結(jié)果可見(jiàn)，C6。(0H)24能夠有效地提高輻射引起小鼠脾細(xì)胞增殖率的降低。實(shí)施例13 C6。(0H)24對(duì)于小鼠脾臟細(xì)胞線粒體膜電位的影響本實(shí)施例中，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察線粒體膜電位，具體方法如下動(dòng)物的 脾臟細(xì)胞培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按如實(shí)施例2所述的處理方法處理后， 加入含20uM JC-l染料的培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育30分鐘，棄去含染料 的培養(yǎng)基，每孔用200 y 1PBS洗一次，再加入200u 1PBS于熒光酶標(biāo)儀度數(shù)， 激發(fā)波長(zhǎng)488頭，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)530nm和590nm，熒光強(qiáng)度比值(590nm/530nm， 紅光比綠光)，作為線粒體膜電位的指標(biāo)。結(jié)果圖13所示，小鼠輻照后，脾臟細(xì)胞線粒體膜電位急劇降低，只有正常 對(duì)照組的30%，而輻照前給予C6。(0H)24組其脾臟細(xì)胞線粒體膜電位明顯升高， 基本和正常組脾臟細(xì)胞線粒體膜電位差不多。**p<0.01，同正常組相比較； ##p<0. 01，同輻照組相比較。由上述結(jié)果可見(jiàn)，C6。(0H)M能有效保護(hù)輻射引起小鼠脾臟細(xì)胞線粒體膜電位 的降低。實(shí)施例14 C6。對(duì)于輻射損傷的修護(hù)作用丙二醛(MDA)是輻射損傷引起脂質(zhì)過(guò)氧化的重要指標(biāo)。本實(shí)施例中，通過(guò) 觀察ICR小鼠輻照后體內(nèi)丙二醛的情況來(lái)驗(yàn)證C6。和C6()(OH)24對(duì)于輻射損傷的 修護(hù)作用。具體實(shí)驗(yàn)方法如下輻照后取小鼠新鮮肝臟，用生理鹽水制成10%的勻漿。 MDA測(cè)定用硫代巴比妥酸法，采用南京建成生物工程研究所的MDA試劑盒進(jìn)
行測(cè)定，具體測(cè)定方法按試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。結(jié)果如圖14所示，可以看出，ICR小鼠受到輻照后，肝組織勻漿的MDA 顯著升高，說(shuō)明輻照后肝脂質(zhì)產(chǎn)生大量過(guò)氧化產(chǎn)物。而輻照前分別給予4g/kg 的Ceo和C6o(OH)24能降低輻射引起的過(guò)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，對(duì)輻射引起的損傷有一定的保護(hù)作用。其中，C60(OH)24的輻射效果要好于C60。此外，本發(fā)明人還驗(yàn)證了 C6。(0H)24以及羥基數(shù)量少于24的其它C6。多羥基 衍生物的混合物對(duì)于線粒體損傷的修護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該混合物也具有線粒 體修護(hù)作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被 單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1. 一種式I所示化合物或由多種式I所示化合物形成的混合物的用途，C60(OH)nI，其中，n為0-24的正整數(shù)；其特征在于，所述的化合物或混合物用于制備防治線粒體損傷相關(guān)疾病的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，n為16-24的正整數(shù)。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的線粒體損傷相關(guān)疾病 選自-神經(jīng)退行性疾病、輻射病、2型糖尿病。
4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于改善免 疫功能。
5. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于 提高細(xì)胞活性；提高細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位； 提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平； 防止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氧化損傷； 防止細(xì)胞內(nèi)DNA損傷； 提高細(xì)胞內(nèi)線粒體傳遞鏈復(fù)合酶的活性； 提高細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)；禾口/或降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平； 清除細(xì)胞內(nèi)自由基。
6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的線粒體傳遞鏈復(fù)合酶 選自線粒體傳遞鏈復(fù)合酶I、線粒體傳遞鏈復(fù)合酶II。
7. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的自由基選自超氧自 由基、羥基自由基、和/或脂質(zhì)自由基。
8. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞選自神經(jīng)上皮 細(xì)胞、脾臟細(xì)胞或肝臟細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于 降低哺乳動(dòng)物肝臟線粒體活性氧水平；促進(jìn)哺乳動(dòng)物脾細(xì)胞增殖；和/或提高哺乳動(dòng)物脾臟細(xì)胞線粒體膜電位。
10. —種體外防止細(xì)胞線粒體損傷方法，其特征在于，所述方法包括 給予細(xì)胞有效量的式I所示化合物或由多種式I所示化合物形成的混合
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種C₆₀或其多羥基衍生物的用途，用于制備防治線粒體損傷相關(guān)疾病(如神經(jīng)退行性疾病或輻射病)的組合物。本發(fā)明人構(gòu)建了線粒體損傷相關(guān)疾病的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，充分論證了C₆₀及其多羥基衍生物對(duì)于防治線粒體損傷的優(yōu)異功效，從而為開(kāi)發(fā)以線粒體為靶點(diǎn)的多功能藥物提供了有效途徑。
文檔編號(hào)A61P25/16GK101396372SQ20071004661
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日
發(fā)明者劉健康, 李文新, 蔡小青 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所