專利名稱：：營養(yǎng)組合物在制備恢復(fù)線粒體損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種營養(yǎng)組合物的用途，尤其是一種營養(yǎng)組合物在制備恢復(fù)線粒體損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：線粒體疾病是以線粒體結(jié)構(gòu)和功能缺陷為主要原因的疾病，目前已發(fā)現(xiàn)與線粒體基因(mtDNA)突變有關(guān)的人類疾病多達(dá)百余種。mtDNA發(fā)生突變后，可導(dǎo)致細(xì)胞能量少、細(xì)胞活力下降，最終導(dǎo)致器官乃至整體功能下降，出現(xiàn)疾病或衰老征象。如在惡性腫瘤細(xì)胞中的線粒體明顯減少、氧化代謝趨向降低，而無氧酵解趨向增強(qiáng)。目前對于線粒體疾病的治療方法有如下幾種①補(bǔ)充療法給病人添加呼吸鏈所需的輔酶，如輔酶Q等；②選擇療法選擇ATP合成酶的抑制劑——氯霉素，連續(xù)低劑量使用此藥以促進(jìn)對缺陷線粒體的排斥；③基因療法將線粒體基因轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)，以替代缺陷mtDNA發(fā)揮作用。由于在遺傳學(xué)方面已有如下權(quán)威結(jié)論"不論是器質(zhì)性疾病還是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究其病因"，"人類正常的衰老和死亡也受到基因的調(diào)控"，"不論是防治疾病還是延緩衰老，都可以從基因這個層次上來研究解決問題"為此，基因治療已經(jīng)成為現(xiàn)代科學(xué)研究的熱點(diǎn)?；蛑委熓羌m正與疾病相關(guān)的缺陷基因的一種技術(shù)，現(xiàn)有方法大多都是以正常基因替換異常的致病基因。如將載有治療基因的病毒載體感染靶細(xì)胞；脂質(zhì)體攜帶治療基因穿過靶細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；通過化學(xué)方法將治療基因與特異細(xì)胞受體結(jié)合，開展靶向治療。此外，也有少數(shù)用RNA干擾的方法。雖然1990年開始進(jìn)行第一例基因治療已獲得成功，但仍面臨如下問題有待解決①外源基因在受體表達(dá)不穩(wěn)定、時間短，限制了基因治療的療效；②外源基因移植引起免疫系統(tǒng)對已識別過的外來物產(chǎn)生免疫增強(qiáng)，使病人的治療難以重復(fù)；③病毒載體對病人可能有各種潛在的危險；④許多疾病是由多基因缺陷引起的，無法用單基因糾正解決問題。專利申請?zhí)枮?00710012788.8的專利申請公開了一種"促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖與血紅蛋白合成的營養(yǎng)組合物"。該營養(yǎng)組合物的原料及重量比如下核苷酸90110、精氨酸2030、賴氨酸2030、半胱氨酸1020、甘氨酸2535、組氨酸2030、卵磷脂110130、腦磷脂5070、維生素E0.40.6、維生素C57、葉酸0.020.04、維生素B20.050.07、維生素B60.070.08、維生素B120.00010.0002、鐵0.51.5、鋅0.50.7、錳0.40.6、枸杞多糖1416、葡萄籽提取物1416。可明顯提高血中血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)及血小板(Pit)數(shù)量；可剌激骨髓造血干細(xì)胞的增殖，使造血干細(xì)胞明顯增多；明顯提高細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目；對肝、脾的損傷具有明顯的恢復(fù)作用。該營養(yǎng)組合物適用于營養(yǎng)不良性貧血(缺鐵性貧血及葉酸與維生素B^營養(yǎng)不良性貧血)、紅細(xì)胞生成減少所致貧血以及紅細(xì)胞破壞過多或丟失所致貧血。但是，該專利申請3文件沒有記載該營養(yǎng)組合物具有恢復(fù)線粒體損傷的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是發(fā)現(xiàn)了上述營養(yǎng)組合物對于損傷的線粒體具有恢復(fù)作用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種營養(yǎng)組合物在制備恢復(fù)線粒體損傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明作為藥物可為線粒體損傷的恢復(fù)提供基本營養(yǎng)條件，進(jìn)而充分發(fā)揮機(jī)體對線粒體損傷的自主修復(fù)本能，達(dá)到恢復(fù)線粒體損傷的目的。本發(fā)明解決了向機(jī)體植入外源基因所存在的種種問題，具有有效、安全、簡便、經(jīng)濟(jì)、不產(chǎn)生免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)。圖1是本發(fā)明實(shí)施例各實(shí)驗(yàn)組造血細(xì)胞、肝細(xì)胞及脾細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位示意圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例各實(shí)驗(yàn)組造血細(xì)胞、肝細(xì)胞及脾細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA含量示意圖。具體實(shí)施例方式1.建立模型、實(shí)驗(yàn)分組和實(shí)驗(yàn)流程再生障礙性貧血小鼠模型的建立本實(shí)驗(yàn)采用BALB/c小鼠。實(shí)驗(yàn)步驟第1天皮下注射乙酰苯肼100mg/kg，次日X射線2.OGy照射后，于第5天環(huán)磷酰胺80mg/kg腹腔注射，第15天重復(fù)以上步驟但不給予射線處理。以單純等量生理鹽水相應(yīng)部位注射為正常對照組。實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)動物藥理學(xué)的藥品劑量和綜合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)分析，分為①正常對照組；②再障模型組；③高劑量組，以1445.55mg/kg.d營養(yǎng)組合物對再障小鼠灌胃；中劑量組，以963.7mg/kg.d營養(yǎng)組合物對再障小鼠灌胃；⑤低劑量組，以674.59mg/kg.d營養(yǎng)組合物對再障小鼠灌胃。實(shí)驗(yàn)流程首先，按前述再障小鼠模型的建立方法，注射乙酰苯肼、環(huán)磷酰胺及X射線照射。從第7天開始，營養(yǎng)組合物高、中、低劑量組分別以相應(yīng)劑量對再障小鼠進(jìn)行灌胃，每天一次，直至第49天，拉頸處死小鼠，采樣進(jìn)行檢測。2.實(shí)驗(yàn)方法2.l線粒體膜電位測定細(xì)胞(5X10S個)接種于25cn^培養(yǎng)瓶中，37t:培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的姜黃素分別作用lh和6h后，收獲細(xì)胞，PBS洗兩遍，重懸于2ml含1.0iiM羅丹明123的新鮮培養(yǎng)液中，37t:水浴振搖孵育10min，離心去掉細(xì)胞，熒光比色計(jì)測定培養(yǎng)液中羅丹明123的強(qiáng)度，激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長520nm，結(jié)果以細(xì)胞吸收的羅丹明123的熒光強(qiáng)度表示。2.2線粒體DNA含量測定將骨髓單個核細(xì)胞(5X100、新鮮組織肝臟、脾、勻漿、裂解、離心，獲取線粒體。按照DNA提取試劑盒說明提取線粒體中的DNA，采用紫外分光光度計(jì)測量其含量。計(jì)算公式如下DNA濃度(yg/Pi)=A26。X50iig/mlX稀釋倍數(shù)X10—32.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每一項(xiàng)分析至少有三次結(jié)果。數(shù)值用均數(shù)±SD表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為有顯著性差異，并在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1線粒體膜電位測定采用熒光探針羅丹明123(Rhl23)測定營養(yǎng)組合物對各實(shí)驗(yàn)組線粒體膜電位的影響。Rhl23為親脂性陽離子熒光素，能順利通過活細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體膜，進(jìn)入線粒體。進(jìn)入線粒體后由于線粒體膜的負(fù)電位差使Rhl23選擇性富集在線粒體上，而在胞漿中卻很少結(jié)合，線粒體對Rh123的攝入量取決于其膜電位的高低。一定的膜電位形成一定的熒光強(qiáng)度且成正比關(guān)系，其熒光強(qiáng)度的大小反映線粒體膜受損程度。如圖1所示與正常對照組相比，再障模型組小鼠造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位呈明顯下降趨勢，表明線粒體功能明顯下降；不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，小鼠造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位明顯增高，呈量效關(guān)系。羅丹明熒光強(qiáng)度的具體數(shù)值見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>#P<0.05再障組與對照組*P<0.05營養(yǎng)組合物組與再障組以上結(jié)果表明營養(yǎng)組合物可促進(jìn)再障小鼠骨髓造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞線粒體膜電位升高。3.2線粒體DNA含量測定采用紫外分光光度計(jì)測定營養(yǎng)組合物對各實(shí)驗(yàn)組線粒DNA含量的影響。如圖2所示與正常對照組相比，再障模型組小鼠造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞線粒體DNA的含量有明顯下降趨勢；不同劑量的營養(yǎng)組合物組與再障模型組比較，小鼠造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞線粒體DNA的含量明顯增高，呈量效關(guān)系。具體數(shù)值見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>#P<0.05再障組與對照組*P<0.05營養(yǎng)組合物與再障組以上結(jié)果表明營養(yǎng)組合物對再障小鼠骨髓造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞線粒體的損傷具有恢復(fù)作用。結(jié)論營養(yǎng)組合物可促進(jìn)再障小鼠骨髓造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞線粒體膜電位增高和DNA含量增加，說明營養(yǎng)組合物對上述細(xì)胞線粒體損傷具有恢復(fù)作用。權(quán)利要求一種營養(yǎng)組合物在制備恢復(fù)線粒體損傷藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開一種營養(yǎng)組合物在制備恢復(fù)線粒體損傷藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明作為藥物可為線粒體損傷的恢復(fù)提供基本營養(yǎng)條件，進(jìn)而充分發(fā)揮機(jī)體對損傷線粒體的自主恢復(fù)本能，達(dá)到恢復(fù)線粒體損傷的目的。本發(fā)明解決了向機(jī)體植入外源基因所存在的種種問題，具有有效、安全、簡便、經(jīng)濟(jì)、不產(chǎn)生免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號A61P39/06GK101780182SQ20101012902公開日2010年7月21日申請日期2010年3月22日優(yōu)先權(quán)日2010年3月22日發(fā)明者吳文國,李恕,董鋒申請人:珍奧集團(tuán)股份有限公司