專利名稱：一種檢測魚類精子線粒體損傷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水產養(yǎng)殖技術，涉及到一種檢測魚類精子線粒體損傷的方法
背景技術：
在養(yǎng)殖生產中常常需要對魚類進行催產繁育，而魚類精子質量的好壞是繁育中非 常重要的一個環(huán)節(jié)，直接影響受精率、孵化率和成活率等。魚類精子排出體外后，其活力容 易受到外界各種環(huán)境因子的影響，不同的環(huán)境條件(溫度、光照等)都會對精子造成一定損 傷，從而影響精子的質量，降低受精率、孵化率和成活率，給養(yǎng)殖生產帶來極大損失。精子線 粒體是維持精子正常生理功能的能量來源，線粒體上含有多種參與能量代謝的酶，給精子 的運動提供所需的能量，因此線粒體功能的好壞直接反映了精子運動能力的強弱。目前檢 測魚 類精子線粒體損傷的方法是通過掃描電鏡和透射電鏡進行觀察，但這種方法只能從外 觀進行定性觀察，不能定量分析和統(tǒng)計，且儀器價格昂貴，操作較為煩瑣。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一種檢測魚類精子線粒體損傷的方法。本發(fā)明采集一定數(shù)量的魚類新鮮精子和經(jīng)過低溫處理的精子，將2份精液標本分 別用0. Olmol/L、PH 7. 4的PBS洗滌2次后300Xg離心5min ；PBS懸浮沉淀精子，調精子 密度為lX106/ml，加入Rhl23，37°C水浴孵育lOmin，離心棄上清，PBS重復洗滌離心2次， PBS懸浮，加入PI，終濃度10ug/ml，染色5min，利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測，儀器 狀態(tài)設置前向散射FSC與側向散射SSC為線性放大，熒光通道FLl和FL2對數(shù)放大，測每 個精子的熒光強度，每份懸液檢測10000個精子，數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件進行分析；右下象 限Rhl23+/PI_為線粒體膜功能良好的精子，左下象限Rhl23+/PI_為線粒體膜功能喪失的精 子，左上象限Rhl237PI+為壞死精子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明通過采用熒光雙染法對線粒體正常和受到損傷的 精子進行染色，經(jīng)過前處理后直接用流式細胞分析儀進行檢測，可定量區(qū)分線粒體膜功能 良好的精子、線粒體膜功能喪失的精子和壞死精子，結果更直觀，更可靠。
具體實施例方式在魚類的繁殖季節(jié)，采集一定數(shù)量的魚類新鮮精子和經(jīng)過低溫處理的精子，將2 份精液標本分別用PBS(0. 01mol/L, PH 7. 4)洗滌2次后300Xg離心5min。PBS懸浮沉 淀精子，調精子密度為IX 106/ml，加入Rhl23(終濃度10ug/ml)，37°C水浴孵育lOmin，離 心棄上清，PBS重復洗滌離心2次，PBS懸浮，加入PI (終濃度10ug/ml)染色5min，利用 FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測，儀器狀態(tài)設置前向散射FSC與側向散 射SSC為線性放大，熒光通道FLl(綠)和FL2(紅)對數(shù)放大，測每個精子的熒光強度，每 份懸液檢測10000個精子，數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件進行分析。新鮮精液與處理精液結果比 較采用非參數(shù)the Mann-Whitney U test進行分析，P < 0. 05為差異顯著。檢測結果中右下象限Rhl23+/PI_(綠色)為線粒體膜功能良好的精子，左下象限Rhl23+/PI_(黑色)為線 粒體膜功能喪失的精子，左上象限Rhl237PI+(紅色)為壞死精子。分別統(tǒng)計線粒體膜功能 良好、線粒體膜功能喪失和壞死精子的比例。
運用此方法能準確檢測魚類精子的線粒體損傷，對損傷程度進行量化，結果更直 觀，更可靠，檢測準確率達到99%以上。
權利要求
一種檢測魚類精子線粒體損傷的方法，采集一定數(shù)量的魚類精子，其特征是將精液標本用0.01mol/L、PH 7.4的PBS洗滌2次后300×g離心5min；PBS懸浮沉淀精子，調精子密度為1×106/ml，加入Rhl23，37℃水浴孵育10min，離心棄上清，PBS重復洗滌離心2次，PBS懸浮，加入PI，終濃度10ug/ml，染色5min，利用FACSCalibur型流式細胞儀檢測，儀器狀態(tài)設置前向散射FSC與側向散射SSC為線性放大，熒光通道FL1和FL2對數(shù)放大，測每個精子的熒光強度，每份懸液檢測10000個精子，數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件進行分析；右下象限Rhl23+/PI-為線粒體膜功能良好的精子，左下象限Rhl23+/PI-為線粒體膜功能喪失的精子，左上象限Rhl23-/PI+為壞死精子。
全文摘要
一種檢測魚類精子線粒體損傷的方法，涉及水產養(yǎng)殖技術，需要提供一種檢測魚類精子線粒體損傷的方法，本發(fā)明采集一定數(shù)量的魚類精子，其特征是精液標本用PBS洗滌后300×g離心5min；PBS懸浮沉淀精子，調精子密度為1×106/ml，加入Rhl23，37℃水浴孵育10min，離心棄上清，PBS重復洗滌離心，PBS懸浮，加入PI，染色5min，通過采用熒光雙染法對線粒體正常和受到損傷的精子進行染色，經(jīng)過前處理后直接用流式細胞分析儀進行檢測，可定量區(qū)分線粒體膜功能良好的精子、線粒體膜功能喪失的精子和壞死精子。
文檔編號G01N21/952GK101846637SQ20091004812
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月24日 優(yōu)先權日2009年3月24日
發(fā)明者馮廣朋, 劉鑒毅, 姚志峰, 莊平, 張濤, 江琪, 章龍珍, 趙峰, 閆文罡, 黃曉榮 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所