人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人類SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，尤其涉及一種快速 有效地檢測少量樣本的SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 他汀類藥物（statins)是三羥基三甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，自 從問世以來就成為世界上臨床使用最為廣泛的降脂藥，該類藥物對抑制心腦血管疾病也有 顯著作用。他汀類藥物通過競爭性抑制HMG-CoA(三羥基三甲基戊二酰輔酶A)還原酶從而 減少膽固醇的生物合成，阻斷細胞內(nèi)羥甲戊酸代謝途徑，使細胞內(nèi)膽固醇合成減少，從而反 饋性刺激細胞膜表面（主要為肝細胞）低密度脂蛋白受體數(shù)量和活性增加、使血清膽固醇 清除增加、水平降低，進而達到降低血脂的作用，是目前防治冠心病、腦中風(fēng)、高血脂、動脈 粥樣硬化的首選用藥。
[0003] 有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽lBl(OATPlBl)參與多種藥物的轉(zhuǎn)運，在他汀類藥物代謝中 負責(zé)將血液中的藥物轉(zhuǎn)移至肝臟中直接發(fā)揮藥效或代謝轉(zhuǎn)化為有活性的物質(zhì)，由定位在12 號染色體上的SLC01B1基因編碼。研宄表明SLC01B1基因具有遺傳多態(tài)性，其中388A>G、 521T>C是兩種常見的單核苷酸多態(tài)性，可以形成4種單倍型SLC01Bl*la(388A-521T)、 SLC01Bl*lb(388G-521T)、SLC01B1*5(388A-521C)和 SLC01B1*15(388G-521C)。突變型 SLC01B1基因引起編碼的0ATP1B1轉(zhuǎn)運蛋白活力減弱，表現(xiàn)為肝臟攝取藥物能力降低，引起 他汀類藥物血藥濃度上升，增加橫紋肌溶解癥或肌病的發(fā)生風(fēng)險。
[0004] 載脂蛋白E(ApoE)通過多種途徑參與機體的脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，是影響機體血脂水 平的重要內(nèi)在因素。ApoE多態(tài)性被認為是高脂蛋白血癥及動脈粥樣硬化性血管病的易 感候選基因。人類ApoE基因定位于19號染色體上，有4個外顯子和3個內(nèi)含子，主要有 兩種單核苷酸多態(tài)性526C>T和388T>C，可以形成3種單倍型分別是ApoE3 (388T-526C)、 ApoE2 (388T-526T)、ApoE4 (388C-526C)。文獻報道，ApoE4攜帶者患冠心病的風(fēng)險要高 40 %，并且他汀類藥物對Ap〇E4攜帶者療效往往不佳或無療效，而對Ap〇E2攜帶者的降脂作 用最強。
[0005] 表1 :SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性
[0006]
【主權(quán)項】
1. 一種SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液，HotStart Taq酶，UNG酶，4組特異性引物，4組特異性探針和內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，其中，所述4組特異性引物序 列分別為 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 與 SEQ ID N0:4;SEQ ID N0:5 與 SEQ ID N0:12〇
2. 如權(quán)利要求1所述的SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述4 組特異性探針序列分別為 SEQ ID NO: 13 與 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 與 SEQ ID NO: 16， SEQ ID NO: 17 與 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 與 SEQ ID NO: 20,且所述特異性探針 5' 端 修飾有FAM或VIC，3'端修飾有NFQ-MGB。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述 內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)包含內(nèi)標(biāo)引物和內(nèi)標(biāo)探針，所述內(nèi)標(biāo)引物序列為SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22， 所述內(nèi)標(biāo)探針序列為SEQ ID N0:23。
4. 如權(quán)利要求3所述的SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征在于，所述內(nèi) 標(biāo)探針5'端修飾有R0X，3'端修飾有BHQ2。
5. 如權(quán)利要求1至4任一項所述的SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，其特征 在于，所述檢測試劑盒含有陽性對照液和空白對照液，所述陽性對照液含有7種質(zhì)粒DNA混 合液，所述7種質(zhì)粒DNA分別含有4種不同的SLC01B1等位基因和3種不同的ApoE等位基 因，所述空白對照為Tris-HCl緩沖液。
6. -種用于檢測SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟： (1) 設(shè)計并篩選含有SLC01B1和ApoE的檢測探針，ARMS引物，通用引物； (2) 使用從非細胞體系或細胞體系中提取的基因組DNA作為模板DNA ; (3) 進行實時熒光定量PCR擴增：每個樣本的SLC01B1基因多態(tài)性和ApoE基因多態(tài)性 檢測分4管進行PCR反應(yīng)。
7. -種用于檢測SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性的方法，該方法包括以下步驟： (1) 設(shè)計并篩選特異性擴增與檢測SLC01B1和ApoE基因多態(tài)性的引物組合和探針組 合；制備如權(quán)利要求1至5任選一項所述試劑盒； (2) 獲得待測樣品基因組DNA ; (3) 進行熒光定量PCR擴增：每個樣本分兩個反應(yīng)管分別檢測SLC01B1和ApoE基因的 多態(tài)性，每管中加入特異性引物組和探針組、PCR反應(yīng)緩沖液、Taq酶、UNG酶、內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，將 上述獲得的基因組DNA先后取相同的量加入所述2個反應(yīng)管中并同時進行PCR反應(yīng)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液，dNTP，MgCl2，4組特異性引物，4組特異性探針，內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，HotStart Taq酶、UNG酶。本發(fā)明用于檢測SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性的試劑盒具有特異性強、敏感度高、操作簡單快速、高通量、安全、結(jié)果判讀客觀等優(yōu)勢。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104846085
【申請?zhí)枴緾N201510219089
【發(fā)明人】張喆, 葉婷, 張 浩, 周鵬飛
【申請人】武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月30日