PCSK9 iRNA組合物及其使用方法
【專利說明】PCSK9iRNA組合物及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)
[0002] 本專利申請(qǐng)要求于2012年12月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/733, 518、于2013 年3月15日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/793, 530、于2013年10月4日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng) 號(hào)61/886, 916、以及于2013年10月17日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/892, 188的優(yōu)先權(quán)。 本申請(qǐng)還涉及2011年11月18日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/561，710的優(yōu)先權(quán)。將前述臨 時(shí)專利申請(qǐng)每一者的全部?jī)?nèi)容特此通過引用結(jié)合在此。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)包括已經(jīng)以電子方式以ASCII格式提交并且通過引用以其整體并入本文 中的序列表。創(chuàng)建于2013年10月29日的所述ASCII拷貝被命名為121301-00420_SL.txt， 大小為433, 512個(gè)字節(jié)。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin9(PCSK9)是枯草桿菌蛋白酶絲氨酸蛋白酶 家族的一個(gè)成員。其他八種哺乳動(dòng)物枯草桿菌蛋白酶蛋白酶PCSK1-PCSK8(也稱為PC1/3、 PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6、PACE4、PC7、和S1P/SKI-1)是加工分泌途徑中的很多種蛋白 質(zhì)并且在多樣的生物學(xué)過程中起作用的前蛋白轉(zhuǎn)化酶（博格龍（Bergeron)F. (2000)《分 子內(nèi)分泌雜志》（J.Mol.Endocrinol. )24,1-22,金斯伯格（Gensberg)K.，（1998)《細(xì)胞及 發(fā)育生物學(xué)討論會(huì)文集》（Semin.CellDev.Biol. )9,11-17,賽義達(dá)（Seidah)N.G. (1999) 《大腦研宄》（BrainRes.) 848,45-62,泰勒（Taylor)N.A.，（2003)《美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)會(huì)聯(lián) 合會(huì)雜志》（FASEBJ.) 17,1215-1227,以及周（Zhou)A.，（1999)《生物化學(xué)雜志》〇.81〇1. Chem.)274,20745-20748)。
[0007] 已經(jīng)提出PCSK9在膽固醇代謝中起作用。類似于膽固醇生物合成酶和低密度脂 蛋白受體（LDLR)，PCSK9mRNA表達(dá)通過在小鼠中通過飼喂膳食膽固醇被下調(diào)（麥克斯韋 爾（Maxwell)K.N.，（2003)《脂質(zhì)研宄雜志》（J.LipidRes.)44,2109-2119)，通過他汀類 藥物在H印G2細(xì)胞中被上調(diào)（杜別克（Dubuc)G.，（2004)《動(dòng)脈硬化、血栓形成和血管生物 學(xué)》（Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.) 24,1454-1459)，并且在固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn) 基因小鼠中被上調(diào)（SREBP)(霍頓（Horton)J.D.，（2003)《美國國家科學(xué)院院刊》（?1~〇(：. Natl.Acad.Sci.USA) 100,12027-12032)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PCSK9錯(cuò)義突變與常染色體顯性 高膽固醇血癥形式（Hchola3)相關(guān)（阿比法德爾（Abifadel)M等人（2003)《自然遺傳學(xué)》 (Nat.Genet.) 34,154-156,替姆斯（Timms)K.M., (2004)《人類遺傳學(xué)》（Hum.Genet.) 114， 349-353,樂仁（Leren)T.P. (2004)《臨床遺傳學(xué)》（Clin.Genet. )65,419-422)QPCSK9還可以 在決定一般人群中的LDL膽固醇水平中起作用，因?yàn)閱魏塑账岫鄳B(tài)性（SNP)與日本人的膽 固醇水平相關(guān)（正治（Shioji)K.，（2004)《人類遺傳學(xué)雜志》（J.Hum.Genet. 49, 109-114)。
[0008] 常染色體顯性高膽固醇血癥（ADH)是單基因疾病，其中患者表現(xiàn)出升高的總膽固 醇水平和LDL膽固醇水平、肌腱黃色瘤、和早熟性動(dòng)脈粥樣硬化（雷德（Rader)D.J.，（2003) 《臨床研宄雜志》（J.Clin.Invest.) 111，1795-1803)。ADH和隱性形式，常染色體隱性高 膽固醇血癥（ARH)的發(fā)病機(jī)制（科恩（Cohen)J.C.，2003)《當(dāng)代脂質(zhì)視點(diǎn)》（Curr.Opin. Lipidol.)14，121-127)是由于經(jīng)由肝臟的LDL攝取缺陷。ADH可以由阻止LDL攝取的LDLR突變引起，或者由在LDL上的蛋白質(zhì)（結(jié)合LDLR的載脂蛋白）的突變引起。ARH由ARH蛋 白的突變引起，ARH蛋白對(duì)于經(jīng)由它與網(wǎng)格蛋白的相互作用而內(nèi)吞LDLR-LDL復(fù)合物是必需 的。因此，如果PCSK9突變是HChola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受體介導(dǎo)的LDL 攝取中起作用。
[0009] 過表達(dá)研宄指出PCSK9在控制LDLR水平并因此在控制經(jīng)由肝臟的LDL攝取中 的作用（麥克斯韋爾（Maxwell)K.N. (2004)《美國國家科學(xué)院院刊》（?1~〇(3.似七1^〇&(1. Sci.USA) 101,7100-7105,本加內(nèi)特（Benjannet)S?等人（2004)《生物化學(xué)雜志》（J.Biol. Chem.) 279,48865-48875,帕克（Park)S.W.，（2004)《生物化學(xué)雜志》（J.Biol.Chem.) 279， 50630-50638)。在小鼠中，腺病毒介導(dǎo)的小鼠或人PCSK9過表達(dá)3或4天導(dǎo)致總膽固醇水平 和LDL膽固醇水平的升高，而在LDLR敲除動(dòng)物中未見到這種作用（麥克斯韋爾（Maxwell) K.N. (2004)《美國國家科學(xué)院院刊》（Proc.Natl.Acad.Sci.USA) 101,7100-7105,本加內(nèi) 特（Benjannet)S?等人（2004)《生物化學(xué)雜志》（J.Biol.Chem.) 279,48865-48875,帕克 (Park)S.W.，（2004)《生物化學(xué)雜志》（J.Biol.Chem.) 279, 50630-50638)。另外，PCSK9 過 表達(dá)導(dǎo)致肝臟LDLR蛋白的嚴(yán)重降低，但不影響LDLRmRNA水平、SREBP蛋白水平或SREBP蛋 白的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比例。
[0010] 雖然高膽固醇血癥本身是無癥狀的，但是長(zhǎng)期的血清膽固醇升高可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣 硬化。經(jīng)過幾十年，慢性升高的膽固醇促成動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，動(dòng)脈粥樣硬化可 導(dǎo)致涉及動(dòng)脈的進(jìn)行性狹窄或甚至完全閉塞。另外，更小的斑塊可能破裂并引起凝塊形成 和血流阻斷，從而導(dǎo)致例如心肌梗死和/或中風(fēng)。如果狹窄或閉塞的形成是逐漸的，那么到 組織和器官的血液供應(yīng)緩慢地減少，一直到器官功能變得受損。
[0011] 因此，本領(lǐng)域中存在對(duì)用于PCSK9相關(guān)疾?。ㄈ绺咧Y，例如高膽固醇血癥）的 有效治療的需要。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 如下文更詳細(xì)地描述，在此披露了包含靶向PCSK9的RNAi劑例如雙鏈iRNA劑的 組合物。還披露了使用本發(fā)明的組合物用于抑制PCSK9表達(dá)并且用于治療與PCSK9表達(dá)相 關(guān)的病狀例如高膽固醇血癥的方法。
[0014] 因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了RNAi劑，例如雙鏈RNAi劑，其能夠抑制細(xì)胞中的 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin9 (PCSK9)的表達(dá)，其中該雙鏈RNAi劑包含與反義鏈互 補(bǔ)的有義鏈，其中該反義鏈包含與編碼PCSK9的mRNA的一部分互補(bǔ)的區(qū)域，其中每個(gè)鏈在 長(zhǎng)度上為約14至約30個(gè)核苷酸，其中該雙鏈RNAi劑由式（III)表示：
[0015] 有義鏈：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)廠Na-nq3'
[0016] 反義鏈：3，n/ -Na，-(X，X，X，）k-Nb，-Y，Y，Y，-V_(Z，Z，Z，） 1-V-V5， (III)
[0017] 其中
[0018] i、j、k和1各自獨(dú)立地是0或1 ;
[0019] p、p'、q、和V各自獨(dú)立地是0-6 ;
[0020] 凡和Na'各自獨(dú)立地表示包含0-25個(gè)修飾的或未修飾的或其組合的核苷酸的寡 核苷酸序列，每個(gè)序列包含至少兩個(gè)不同修飾的核苷酸；
[0021] Nb和N/各自獨(dú)立地表示包含0-10個(gè)修飾的或未修飾的或其組合的核苷酸的寡 核苷酸序列；
[0022] 每個(gè)np、np'、nq、和nq'，其中每個(gè)可以是存在的或可以是不存在的，獨(dú)立地表示 突出端核苷酸；
[0023]XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、和Z'Z'Z'各自獨(dú)立地表示在三個(gè)連 續(xù)核苷酸上具有三個(gè)相同修飾的一個(gè)基序；
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