種或多種第二寡核苷酸。在實施方式2 (被展示于圖A)中，所述一種或多種第二寡核苷酸可以是單個寡核苷酸14。在實施方式16 (被展示于圖B)中，所述一種或多種第二寡核苷酸可以是兩種寡核苷酸14a和14b，其中每種各含有與所述第一寡核苷酸雜交的區(qū)域，和不與所述第一寡核苷酸雜交的尾巴。在某些實施方式中，除了分子條碼序列之外，所述一種或多種第二寡核苷酸可以提供擴增和/或測序引物結(jié)合位點。如果使用暈環(huán)探針16，那么這些序列可存在于寡核苷酸14a和14b的尾巴中。圖1中所示的任何一種暈環(huán)探針均可被用于下文所述方法中。僅僅為了方便解釋所述方法，圖中示意了利用圖1的圖A所示的暈環(huán)探針的第一實施方式的方法。
[0076]參考圖2，該方法的一種實施方式包含:將隨機剪切的基因組DNA 20與暈環(huán)探針22雜交以產(chǎn)生第一環(huán)狀復(fù)合物24。如上所述，暈環(huán)探針包含:(i)第一寡核苷酸，其包含與隨機剪切的基因組DNA片段中的不同區(qū)域雜交的側(cè)翼序列，和中心序列；和(ii)與所述第一寡核苷酸的中心序列互補的一種或多種第二寡核苷酸。如圖所示，第一環(huán)狀復(fù)合物24包含具有突出末端26和28的隨機剪切的基因組DNA片段23。如圖所示，暈環(huán)探針的第一寡核苷酸可含有任選的捕獲部分21，例如生物素部分，其可被用來在方法過程中分離復(fù)合物之一。在這些實施方式中，所述方法可任選地涉及:在消化之前，使用捕獲部分分離第一環(huán)狀復(fù)合物。所述方法的下一步涉及酶促消化第一環(huán)狀復(fù)合物中基因組片段的突出末端以提供第二環(huán)狀復(fù)合物30，其中一種或多種第二寡核苷酸的5’和3’末端與經(jīng)消化的基因組片段32的3’和5’末端可連接性鄰近(ligatably adjacent)?？梢远喾N不同方式進行酶促消化。例如，酶促消化可包括:在用于填補任何已被過度消化的末端的聚合酶的任選存在下，使用單鏈特異性雙向核酸外切酶一核酸外切酶VII來消化第一環(huán)狀復(fù)合物。在另一些實施方式中，酶促消化可包括:例如，用包含Pfu DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物、包含T4DNA聚合酶和核酸外切酶VII的混合物處理，用綠豆核酸酶處理，或者用瓣狀核酸內(nèi)切酶和3’核酸外切酶(例如核酸外切酶1、核酸外切酶T、核酸外切酶V)聯(lián)合處理，或者用5’和3’核酸外切酶順次處理。如圖2中所示，所述方法的這種實施方式包括:使經(jīng)消化的基因組片段32的可連接性末端與一種或多種第二寡核苷酸的末端連接(即，連接經(jīng)消化的基因組片段的3’末端和第二寡核苷酸的5’末端之間的可連接性結(jié)點(junct1n) 34，和連接經(jīng)消化的基因組片段的5’末端和第二寡核苷酸的3’末端之間的可連接性結(jié)點36)以產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子40。在某些實施方式中(如圖2中所示)，因為經(jīng)消化的基因組片段32的末端與單一第二寡核苷酸的兩端連接，所以環(huán)狀DNA分子40可以共價成環(huán)。在另一些實施方式中，如果利用暈環(huán)探針的第二種實施方式(如圖1的圖B中所示)，那么環(huán)狀DNA分子40可以非共價成環(huán)。在這些實施方式中，第一寡核苷酸與片段化的基因組片段的5’末端和3’末端二者雜交并使片段末端保持在一起以提供環(huán)狀DNA分子。在這些實施方式中，經(jīng)消化的基因組片段32的5’末端與一種第二寡核苷酸的3’末端相連接，且經(jīng)消化的基因組片段32的3’末端與另一第二寡核苷酸的5’末端相連接。
[0077]圖3中展示了獲得類似于通過圖2所示方法產(chǎn)生的產(chǎn)物的環(huán)狀產(chǎn)物的一種替代性方法。在圖3所示實施方式中，該方法使用RNA寡核苷酸，但任何可消化的寡核苷酸均能夠被使用。參考圖3，該方法的這種實施方式包含:將隨機剪切的基因組DNA 50與RNA寡核苷酸52雜交以產(chǎn)生RNA/DNA雙鏈體56，其中所述RNA寡核苷酸52包含與所述隨機剪切的基因組DNA片段雜交的區(qū)域。RNA/DNA雙鏈體56包含基因組片段58和RNA寡核苷酸52，且所述基因組片段含有突出序列。在某些實施方式中，RNA寡核苷酸52可包含任選的捕獲部分，例如生物素部分54。在這些實施方式中，所述方法可包括:在下述消化步驟之前，使用捕獲部分分離酶促消化的第一復(fù)合物56。產(chǎn)生雙鏈體之后，該方法包括:酶促消化RNA/DNA雙鏈體中基因組片段的突出末端以提供雙鏈體59，所述雙鏈體59包含作為確定末端的經(jīng)消化基因組片段60。酶促消化使用類似于上述方法的方法。例如，酶促消化可包括:在用于填補任何已被過度消化的末端的聚合酶的任選存在下，使用單鏈特異性雙向核酸外切酶一核酸外切酶VII來消化第一環(huán)狀復(fù)合物。例如，在另一些實施方式中，酶促消化可包括:用包含Pfu DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶的混合物、包含T4DNA聚合酶和核酸外切酶VII的混合物處理，用綠豆核酸酶處理，或者用瓣狀內(nèi)切核酸酶和3’核酸外切酶(例如核酸外切酶
1、核酸外切酶T、核酸外切酶V)聯(lián)合處理，或者用5’和3’核酸外切酶順次處理。這種實施方式中使用的寡核苷酸的長度可在10-200個核苷酸范圍內(nèi)，例如10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80、80-100、100-150 或 150-200 個核苷酸范圍內(nèi)。
[0078]雙鏈體59產(chǎn)生后，所述方法可包括:消化除去雙鏈體的RNA寡核苷酸以釋放經(jīng)消化的基因組片段62。接下來，所述方法可包括:使經(jīng)消化的基因組片段62與暈環(huán)探針64雜交，其實例在圖1中被闡釋。如圖所示，暈環(huán)探針可包含第一寡核苷酸66 (其包含與經(jīng)消化的基因組片段的末端雜交的側(cè)翼序列，和中心序列)和與所述第一寡核苷酸的中心序列互補的一種或多種第二寡核苷酸68以提供第二復(fù)合物70，其中所述第二寡核苷酸的5’和3’末端與經(jīng)消化的基因組片段的3’和5’末端可連接性鄰近。所述方法的這種實施方式包括:使經(jīng)消化的基因組片段70的可連接性末端與一種或多種第二寡核苷酸的末端連接以產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子72。在某些實施方式中(如圖3中所示)，因為經(jīng)消化的基因組片段60的末端與單一第二寡核苷酸的兩端連接，所以環(huán)狀DNA分子72可以共價成環(huán)。在某些情況下，如果使用暈環(huán)探針的第二實施方式(如圖1的圖B中所示)，那么環(huán)狀DNA分子72可以非共價成環(huán)。在這些實施方式中，第一寡核苷酸與片段化的基因組片段的5’末端和3’末端二者雜交并使片段末端保持在一起以提供環(huán)狀DNA分子。在這種實施方式中，第一寡核苷酸將環(huán)末端保持在一起。在這種實施方式中，經(jīng)消化的基因組片段60的5’末端與一種第二寡核苷酸的3’末端相連接，且經(jīng)消化的基因組片段60的3’末端與另一第二寡核苷酸的5’末端相連接。在這種實施方式中，可使用NaOH或RNAseH處理消化雙鏈體59的RNA寡核苷酸，但任何合適的消化方法均可被使用。
[0079]在任何上述實施方式中，可使用化學(xué)、物理或轉(zhuǎn)座酶催化片段化方法從基因組DNA產(chǎn)生隨機剪切的基因組DNA，參見，例如，Adey等人(Genome B1logy 2010，11:R119)。例如，物理片段化方法可以是超聲、霧化或剪切基因組DNA。在某些實施方式中，在進行所述方法之前，可將基因組DNA片段化至平均尺寸在10bp-1Okb (例如200bp-lkb)范圍內(nèi)。
[0080]圖4示意性闡釋了能夠?qū)θ魏紊鲜鰧嵤┓绞街械慕?jīng)消化基因組片段進行擴增和測序的方法。如圖4中所示，可使用反向PCR引物86和88擴增產(chǎn)物DNA分子80 (其包含經(jīng)消化的基因組片段82和一種或多種第二寡核苷酸，其可為如所示的環(huán)形，或者為線性，這取決于所使用的暈環(huán)探針的類型)，其中所述引物86和88與所述一種或多種第二寡核苷酸提供的位點結(jié)合。在所示實施方式中，引物86和88與單一第二寡核苷酸提供的位點結(jié)合。在另一些實施方式中，引物86和88的結(jié)合位點可由圖1的圖B中所示的兩種第二寡核苷酸的尾巴提供?？蓪U增產(chǎn)物90進行測序以提供至少部分的消化的基因組片段的核苷酸序列。在某些實施方式中，可使用與所述一種或多種第二寡核苷酸中的測序引物位點雜交的引物進彳丁測序。
[0081]將顯而易見的是，在某些實施方式中，通過一種或多種第二寡核苷酸添加的序列可含有適合用于下一代測序平臺的序列，所述測序平臺例如，Illumina的可逆性終止法、Roche的焦磷酸測序法(454)、Life Technologies的連接測序法(SOLiD平臺)或Life Technologies的離子激流平臺。下列參考文獻中描述了這種方法的實施例:Margulies 等人(Nature 2005437:376-80) ；Ronaghi 等人(Analytical B1chemistry
1996242:84-9) ；Shendure (Science 2005309: 1728) ；Imelfort 等人(BriefB1inform.200910:609-18) ;Fox等人(Methods Mol B1l.2009 ;553:79-108) ；Appleby#人(Methods Mol B1l.2009 ；513:19-39)和 Morozova (Genomics.200892:255-64)，其中關(guān)于方法和方法的具體步驟(包括每個步驟的起始產(chǎn)物、試劑和終產(chǎn)物全部)的一般描述的通過引用被并入本文。序列可存在于一種或多種第二寡核苷酸中(在它們的尾巴中或在與第一寡核苷酸雜交的序列中)。在某些實施方式中，一種或多種第二寡核苷酸可含有兩組引物結(jié)合位點，一組用于通過反向PCR擴增環(huán)狀DNA，另一組用于對由此得到的產(chǎn)物進行測序。一種或多種第二寡核苷酸還可包含位于擴增和測序引物結(jié)合位點下游的分子條碼，其可被用來鑒定序列來自哪個樣品，或計算多少不同的起始分子已被測序。在另一些實施方式中，可使用納米孔測序?qū)U增子進行測序(例如，如Soni等人Clin Chem 53:1996-20012