007中所述，或如Oxford Nanopore Technologies所述)。納米孔測(cè)序是單分子測(cè)序技術(shù)，其中單個(gè)DNA分子在通過納米孔時(shí)被直接測(cè)序。納米孔是小洞，其直徑約lnm。將納米孔浸入傳導(dǎo)流體并越過它應(yīng)用電勢(shì)(電壓)導(dǎo)致微量電流，這是因?yàn)殡x子通過納米孔被傳導(dǎo)。流過的電流量對(duì)納米孔的尺寸和形狀敏感。當(dāng)DNA分子穿過納米孔時(shí)，DNA分子上的每個(gè)核苷酸不同程度阻塞納米孔，從而不同程度改變通過納米孔的電流的量級(jí)。因此，這種DNA分子穿過納米孔時(shí)的電流改變代表DNA序列的讀取。納米孔測(cè)序技術(shù)在美國(guó)專利號(hào) 5，795，782，6，015，714，6，627，067，7，238，485 和 7，258，838 以及美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?006003171 和 20090029477 中被描述。
[0082]主題暈環(huán)探針各個(gè)區(qū)域的長(zhǎng)度可變化很大，這取決于期望的應(yīng)用以及所述一種或多種第二寡核苷酸攜帶的載量(freight多少)(即，多少個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)、條碼等)。在某些實(shí)施方式中，暈環(huán)探針雙鏈區(qū)域的長(zhǎng)度可為20-100個(gè)堿基對(duì)(例如30bp-60bp)，且側(cè)翼區(qū)域(其能夠與基因組中的靶片段特異性雜交)序列的長(zhǎng)度可為10-100個(gè)堿基對(duì)(例如12bp-50bp)。應(yīng)該顯而易見的是，暈環(huán)探針雙鏈區(qū)域的核苷酸序列應(yīng)被設(shè)計(jì)從而它不與所研宄的基因組雜交。
[0083]上述方法可被用來操作和分析來自幾乎任何核酸來源的DNA，包括但不限于基因組DNA和互補(bǔ)DNA、質(zhì)粒DNA、線粒體DNA、合成DNA和BAC克隆等。此外，任何生物體、有機(jī)材料或含核酸的物質(zhì)均可被用作將依照本發(fā)明被處理的核酸來源，包括但不限于，植物、動(dòng)物(例如，爬行動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、昆蟲、蠕蟲、魚類、等)、組織樣品、細(xì)菌、真菌(例如，酵母)、噬菌體、病毒、尸體組織、考古學(xué)上的/古代的樣品，等等。在某些實(shí)施方式中，所述方法中使用的初始DNA可來源于哺乳動(dòng)物，其中在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是人類。
[0084]在某些實(shí)施方式中，被分析的初始DNA可來源于單一來源(例如，單一生物體、病毒、組織、細(xì)胞、對(duì)象等)，然而在另一些實(shí)施方式中，核酸樣品可以是從多個(gè)來源提取的核酸的合并物(例如來自多種生物體、組織、細(xì)胞、對(duì)象等的核酸合并物)，其中“多種”表示兩種或更多種。因而，在某些實(shí)施方式中，核酸樣品可含有來自2種或更多種來源，3種或更多種來源，5種或更多種來源，10種或更多種來源，50種或更多種來源，100種或更多種來源，500種或更多種來源，1000種或更多種來源，5000種或更多種來源，多達(dá)并包括約10000種或更多種來源的核酸。分子條碼可允許來自不同來源的序列在分析之后被區(qū)分。此外，反應(yīng)可以是多重的以在單個(gè)反應(yīng)中靶向多個(gè)不同靶位點(diǎn)(例如，10-1000)。
_5] 試劑盒
[0086]本公開還提供用于實(shí)行如上所述本發(fā)明方法的試劑盒(kit)。所述試劑盒至少含有所述暈環(huán)探針，以及用于進(jìn)行所述方法的合適反應(yīng)試劑(例如，緩沖液等)。根據(jù)期望，試劑盒的各種組分可出現(xiàn)在分開的容器中或者某些相容組分可被預(yù)先組合在單個(gè)容器中。
[0087]除了上述組分之外，所述試劑盒可進(jìn)一步包含關(guān)于使用所述試劑盒的組分來實(shí)行所述方法的說明(即，樣品分析說明)。實(shí)行所述方法的說明通常記錄在合適的記錄介質(zhì)上。例如，說明可被印刷在基質(zhì)(例如紙或塑料，等)上。因而，說明可作為包裝插入物(insert)出現(xiàn)在試劑盒中，在試劑盒或其組分的容器標(biāo)記中(即，與包裝或小包裝相關(guān))等。在另一些實(shí)施方式中，說明可以作為存在于合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)(例如，⑶-ROM、磁盤等)上的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件被呈現(xiàn)。在又一些實(shí)施方式中，實(shí)際說明未出現(xiàn)在試劑盒中，但從遠(yuǎn)程來源(例如，通過因特網(wǎng))獲得說明的方法被提供。這種實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例是包括網(wǎng)址的試劑盒，其中可在所述網(wǎng)址查看說明并/或可從所述網(wǎng)址下載說明。與說明一樣，這種獲得說明的方法被記錄在合適基質(zhì)上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種方法，其包括 (a)使隨機(jī)剪切的基因組DNA與暈環(huán)探針雜交以產(chǎn)生第一環(huán)狀復(fù)合物，其中所述暈環(huán)探針包含: (i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含與所述隨機(jī)剪切的基因組DNA的片段中的不同區(qū)域雜交的側(cè)翼序列，以及中心序列；和 (?)與所述第一寡核苷酸的中心序列互補(bǔ)的一種或更多種第二寡核苷酸； (b)酶促消化第一環(huán)狀復(fù)合物中基因組片段的突出末端，以提供其中所述一種或更多種第二寡核苷酸的5’和3’末端與經(jīng)消化基因組片段的3’和5’末端可連接性鄰近的第二環(huán)狀復(fù)合物；和 (C)使(C)的經(jīng)消化基因組片段的末端與所述一種或更多種第二寡核苷酸的末端連接以產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所述方法包括: (d)使用與所述一種或更多種第二寡核苷酸提供的位點(diǎn)結(jié)合的一種或更多種引物，從所述環(huán)狀DNA分子擴(kuò)增經(jīng)消化的基因組片段。
3.權(quán)利要求2所述方法，其還包括: (e)對(duì)(d)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以提供至少部分的經(jīng)消化基因組片段的核苷酸序列。
4.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中所述第一寡核苷酸包含捕獲部分，且其中所述方法在步驟(a)和(b)之間包括:使用所述捕獲部分分離所述第一環(huán)狀復(fù)合物。
5.權(quán)利要求3所述方法，其中使用與所述一種或更多種第二寡核苷酸中的測(cè)序引物位點(diǎn)雜交的引物進(jìn)行所述測(cè)序。
6.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中所述酶促消化包括:在聚合酶的任選存在下，使用單鏈特異性雙向核酸外切酶消化所述第一環(huán)狀復(fù)合物。
7.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中所述單鏈特異性雙向核酸外切酶是核酸外切酶 VI1
8.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中所述酶促消化包括:用PfuDNA聚合酶/TaqDNA聚合酶混合物、T4DNA聚合酶/核酸外切酶VII混合物處理，用綠豆核酸酶處理，用瓣?duì)詈怂醿?nèi)切酶和另一種3’核酸內(nèi)切酶聯(lián)合處理。
9.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中使用化學(xué)、物理或轉(zhuǎn)座酶催化的片段化方法從基因組DNA產(chǎn)生所述隨機(jī)剪切的基因組DNA。
10.權(quán)利要求8所述方法，其中所述物理的片段化方法包括超聲、霧化或剪切。
11.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中所述一種或更多種第二寡核苷酸是與所述第一寡核苷酸的中心序列互補(bǔ)的單一寡核苷酸。
12.在前權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述方法，其中所述一種或更多種第二寡核苷酸是兩種寡核苷酸，其每種都包含與所述第一寡核苷酸雜交的第一區(qū)域，和提供一個(gè)或更多個(gè)擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)的第二區(qū)域。
13.—種方法，其包括: (a)使隨機(jī)剪切的基因組DNA與RNA寡核苷酸雜交以產(chǎn)生RNA/DNA雙鏈體，所述RNA寡核苷酸包含與所述隨機(jī)剪切的基因組DNA的片段雜交的區(qū)域； (b)酶促消化所述RNA/DNA雙鏈體中基因組片段的突出末端，以提供包含具有確定末端的經(jīng)消化基因組片段的雙鏈體； (C)消化(b)的雙鏈體的RNA寡核苷酸以釋放經(jīng)消化的基因組片段； (d)使(C)的經(jīng)消化基因組片段與暈環(huán)探針雜交，所述暈環(huán)探針包含: (i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含與經(jīng)消化的基因組片段的末端雜交的側(cè)翼序列，以及中心序列；和 (?)與所述第一寡核苷酸的中心序列互補(bǔ)的一種或更多種第二寡核苷酸，以提供其中所述第二寡核苷酸的5’和3’末端與經(jīng)消化的基因組片段的3’和5’末端可連接性鄰近的第二復(fù)合物； (e)使經(jīng)消化的基因組片段的末端與所述第二寡核苷酸連接以產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子。
14.權(quán)利要求13所述方法，其中所述RNA寡核苷酸包含捕獲部分，且所述方法包括:使用所述捕獲部分分離(b)的酶促消化的第一復(fù)合物。
15.權(quán)利要求13或14所述方法，其中利用NaOH或RNAseH處理來完成所述消化步驟(C)。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述方法，其中所述方法包括: (f)使用與所述第一寡核苷酸的中心序列中的位點(diǎn)結(jié)合的一種或更多種引物，從所述環(huán)狀DNA分子擴(kuò)增經(jīng)消化的基因組片段。
17.權(quán)利要求16所述方法，其還包含: (g)對(duì)(f)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
18.權(quán)利要求17所述方法，其中使用與所述一種或更多種第二寡核苷酸提供的測(cè)序引物位點(diǎn)雜交的引物完成所述測(cè)序。
19.權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述方法，其中所述酶促消化包括:使用核酸外切酶VII消化所述第一復(fù)合物。
20.權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述方法，其中所述第一探針包含捕獲部分，且所述方法包括:在所述連接步驟(e)之前分離(d)的所述第二復(fù)合物。
【專利摘要】本發(fā)明提供用于富集存在于隨機(jī)剪切的基因組DNA中的靶片段的多種方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法可涉及：使隨機(jī)剪切的基因組DNA與暈環(huán)探針雜交以產(chǎn)生第一環(huán)狀復(fù)合物，然后酶促消化基因組片段的突出末端。另一些實(shí)施方式可包括：使隨機(jī)剪切的基因組DNA與RNA寡核苷酸雜交以產(chǎn)生RNA/DNA雙鏈體，所述RNA寡核苷酸包含與所述隨機(jī)剪切的基因組DNA的片段雜交的區(qū)域。然后可以酶促消化RNA/DNA雙鏈體中的基因組片段的突出末端。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-10
【公開號(hào)】CN104854246
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380063759
【發(fā)明人】斯科特·哈珀, 艾米麗·馬林·勒普魯, 茱莉亞·巴波扎, 約瑟夫·晃·海·翁
【申請(qǐng)人】安捷倫科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2013年10月3日
【公告號(hào)】WO2014088694A1