針對間變性淋巴瘤激酶的單克隆抗體1a4及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及特異性結(jié)合間變性淋巴瘤激酶（ALK) 的單克隆抗體1A4,產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述單克隆抗體的使用方法，以及包 含所述單克隆抗體的組合物和試劑盒。 發(fā)明背景
[0002] 肺癌是世界上最常見的癌癥，每年新診斷出1400萬新病例（P. Boyle，World Cancer Report2008 (World Health Organization, 2009))。隨著人類分子遺傳學(xué)的發(fā)展， 已經(jīng)鑒別出若干肺癌的致癌驅(qū)動突變，且其中一部分已經(jīng)用作個體化醫(yī)療的生物標(biāo)志物及 靶點，例如 EGFR 突變（Rosell et al.，Lancet382，p720-731, 2013)。
[0003] 最近的遺傳學(xué)研究顯示大于6%的非小細(xì)胞肺癌患者具有間變性淋巴瘤激酶 (ALK)基因易位（Camidge&Doebele,Nat Rev Clin 0此〇19，？268-277,2012)。六1^易位最初 是在白血病中鑒別到，然而隨后在若干實體瘤中也檢測出ALK易位（Chiarle et al. ,Nat Rev Cancer8, pi 1-23, 2008)。正常時，ALK只在胚胎發(fā)生時表達(dá)且在成人組織中基本上是沉 默的。然而，致癌性易位導(dǎo)致表達(dá)含有C-端自活化的ALK激酶結(jié)構(gòu)域的融合蛋白（Chiarle et al.，NatRev Cancer8，pll-23,2008)。在不同的癌癥類型中已經(jīng)鑒別到多種的5'端ALK 融合配對物，在肺癌中主要是EML4。已經(jīng)報道了至少8種不同的EML4-ALK融合模式。
[0004] 臨床上，被篩查出具有ALK易位的患者可以使用ALK激酶的ATP競爭性抑制劑克 唑替尼進(jìn)行靶向性治療（Camidge&Doebele，Nat Rev Clin0ncol9，p268-277,2012)。目前 FDA批準(zhǔn)的篩查ALK易位的方法基于原位雜交熒光技術(shù)（FISH)。然而，F(xiàn)ISH需要對實驗過 程的精確標(biāo)定以及需要高度熟練的技術(shù)人員以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。在許多病理學(xué)實驗室中， FISH并不是常規(guī)測試。另一種檢測ALK易位的方法是定量PCR。定量PCR是檢測EML4-ALK 融合模式的常規(guī)方法。然而這樣的定量PCR平臺是專門化的平臺，并不適合于所有的病 理實驗室。而且，大部分常見定量PCR檢測ALK的方法都限于EML4-ALK融合（Soda et al.，Nature448, p561-566, 2007)，而其它的例如 Klf5B-ALK 和 KLCl-ALK 等則無法檢測。
[0005] 免疫組化（IHC)是目前在病理實驗室中最廣泛使用的檢測方法，主要得益于其 低廉的成本和簡便的操作。已報道ALK易位導(dǎo)致在肺癌樣品中存在功能性融合蛋白的表 達(dá)，暗示可以使用針對ALK的抗體通過免疫組化（IHC)來篩查ALK易位（Thunnissen et al.，Virchows Arch461，p245-257, 2012)。然而，ALK易位造成的ALK融合蛋白在肺癌中的 表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其在白血病中的表達(dá)，因此通過IHC檢測肺癌中的ALK融合蛋白需要高靈敏 度的抗體（Mino-Kenudson et al·，Clin Cancer Resl6，pl561_1571, 2010)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種高靈敏度的抗ALK小鼠單克隆抗體1A4,其可用于通過免疫組 化檢測癌癥如肺癌中的ALK易位。
[0007] 在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和組織 培養(yǎng)、微生物學(xué)、免疫學(xué)相關(guān)術(shù)語和實驗室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常 規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。
[0008] 如本文所用，"抗體"指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，無論天然的或者部分或全 部合成（例如重組）產(chǎn)生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可變區(qū)的保留全長免 疫球蛋白的結(jié)合特異性能力的任何片段。因此，抗體包括具有與免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu) 域（抗體結(jié)合位點）同源或基本上同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何蛋白。抗體包括抗體片段，例 如抗ALK抗體片段。如本文所用，因此術(shù)語抗體包括合成抗體、重組產(chǎn)生的抗體、多特異性 抗體（例如雙特異性抗體）、人抗體、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、胞內(nèi)抗體以及抗體 片段，例如但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段、Fv片段、二硫鍵連接的Fv(dsFV)、 Fd片段、Fd'片段、單鏈Fv(scFv)、單鏈Fab(scFab)、雙抗體、抗獨特型（抗Id)抗體、或者 上述任何抗體的抗原結(jié)合片段。本文所提供的抗體包括任何免疫球蛋白類型（例如，IgG、 IgM、IgD、IgE、IgA 和 IgY)、任何類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類 (例如，IgG2a和IgG2b)的成員。
[0009] 如本文所用，抗體的"抗體片段"或"抗原結(jié)合片段"指全長抗體的任何部分，其 少于全長，但是至少包含結(jié)合抗原的所述抗體的部分可變區(qū)（例如一個或多個CDR和/或 一個或多個抗體結(jié)合位點），并且因此保留結(jié)合特異性以及所述全長抗體的至少部分特異 性結(jié)合能力；抗體片段包括通過酶促處理全長抗體所產(chǎn)生的抗體衍生物，以及合成產(chǎn)生的 衍生物，例如重組產(chǎn)生的衍生物。抗體包括抗體片段?？贵w片段的實例包括但不限于Fab、 ? &13'、？(&13'）2、單鏈？以8〇?0、？1(18?1雙抗體、？(1和？(1'片段以及其他片段，包括修飾的 片段（參見，例如，Methods in Molecular Biology, Vol207:Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2〇〇3); Chapterl ;p3-25，Kipriyanov)。所述片 段可以包括連接在一起的多條鏈，例如通過二硫鍵和/或通過肽接頭?？贵w片段一般包含 至少或約50個氨基酸，并且典型至少或約200個氨基酸。
[0010] 如本文所用，抗原結(jié)合片段指包含抗原結(jié)合部分的抗體片段，其與所述抗體片段 所來源的抗體結(jié)合相同的抗原。如本文所用，抗原結(jié)合片段包括任何抗體片段，其在被插 入抗體框架（例如通過置換相應(yīng)區(qū)域）時獲得免疫特異性地結(jié)合（即表現(xiàn)出至少或至少 約IO7-IO8M- 1的Ka)抗原的抗體?？乖Y(jié)合片段包括抗體片段，例如Fab片段、Fab'片段、 F(ab'）2片段、Fv片段、二硫鍵連接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd'片段、單鏈Fv(scFv)、單鏈 Fab (scFab)，并且還包括其他片段，例如包含⑶R的片段，以及免疫特異性地結(jié)合抗原的多 肽或在插入抗體框架時獲得免疫特異性地結(jié)合抗原的抗體的多肽。
[0011] 如本文所用，"單克隆抗體"指相同抗體的群體，表示單克隆抗體的群體中的每個 單獨的抗體分子與其他抗體分子相同。這種特性是與抗體的多克隆群體的特性相比，所 述抗體的多克隆群體包含具有多種不同序列的抗體。單克隆抗體可以通過許多公知的方 法來制備（Smith et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57, 912-917;和 Nelson et al·，J Clin Pathol (2000)，53, 111-117)。例如，單克隆抗體可以通過永生化B細(xì)胞來制備，例如通過與 骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞系或者通過用諸如EBV的病毒感染B細(xì)胞。重組技術(shù)還 可以用來在體外通過用攜帶編碼抗體的核苷酸的人工序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞來從宿主 細(xì)胞的克隆群體制備單克隆抗體。
[0012] 如本文所用，全長抗體或完整抗體是具有兩條全長重鏈（例如VH-CH1-C H2-CH3或 VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和兩條全長輕鏈（VCJ和鉸鏈區(qū)的抗體，例如通過抗體分泌B細(xì)胞天 然產(chǎn)生的人抗體以及合成產(chǎn)生的具有相同結(jié)構(gòu)域的抗體。
[0013] 如本文所用，F(xiàn)v抗體片段由通過非共價相互作用連接的一個可變重鏈結(jié)構(gòu)域（Vh) 和一個可變輕鏈（VJ結(jié)構(gòu)域組成。dsFv指具有穩(wěn)定V H_'對的工程化分子間二硫鍵的Fv。 Fd片段是包含抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域（Vh)和一個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域（ChI)的抗體片段。Fab片 段是用木瓜蛋白酶消化全長免疫球蛋白所獲得的片段，或者例如通過重組方法合成產(chǎn)生的 具有相同結(jié)構(gòu)的片段。Fab片段包含輕鏈（包含\和CJ和另一條鏈，所述另一條鏈包含 重鏈的可變結(jié)構(gòu)域（V h)和重鏈的一個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域（ChI)。F(ab'）