糖蛋白的產(chǎn)生的制作方法
【專利說明】糖蛋白的產(chǎn)生
[0001] 本申請是申請日為2007年7月11日、發(fā)明名稱為"糖蛋白的產(chǎn)生"的中國專利申 請 200780033112. 5 (國際申請?zhí)?PCT/US2007/015767)的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及在包含錳的細(xì)胞培養(yǎng)基中產(chǎn)生糖蛋白的方法，和用于這種方法的細(xì)胞 培養(yǎng)基。
[0003] 相關(guān)申請的參考
[0004] 本申請是2006年7月13日提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/830, 658的共同待決 申請，并且與其有至少一個(gè)共同發(fā)明人并且要求該美國臨時(shí)專利申請的優(yōu)先權(quán)，將該美國 臨時(shí)專利申請的內(nèi)容完整引入本文作為參考。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 蛋白質(zhì)和多肽已經(jīng)成為越來越重要的治療劑。在多數(shù)情況下，這些蛋白質(zhì)和多肽 在細(xì)胞培養(yǎng)物中從細(xì)胞產(chǎn)生，所述細(xì)胞已經(jīng)被人工改造和/或選擇以產(chǎn)生不尋常的高水平 的特定目的蛋白質(zhì)或多肽。細(xì)胞培養(yǎng)條件的控制和優(yōu)化對于蛋白質(zhì)和多肽的成功的商業(yè)化 生產(chǎn)是尤其重要的。
[0007] 細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的許多蛋白質(zhì)和多肽是糖蛋白，其含有共價(jià)連接的糖類結(jié)構(gòu)， 包括寡糖鏈。這些寡糖鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中通過N-連接或0-連接連接到蛋白質(zhì)。寡 糖鏈可以占糖蛋白質(zhì)量的大部分。認(rèn)為寡糖鏈在糖蛋白的功能中起重要作用，包括促進(jìn)糖 蛋白的正確折疊、介導(dǎo)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用、賦予穩(wěn)定性、賦予有利的藥物動(dòng)力學(xué)和/ 或藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、抑制蛋白酶解消化、將糖蛋白靶向正確的分泌途徑和將糖蛋白靶 向一個(gè)或多個(gè)特定器官。
[0008] 通常，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，N-連接的寡糖鏈加入新生的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（見Alberts等 人，Molecular Biology of the Cell, 1994,引入本文作為參考）。寡糖被加入目標(biāo)共有序 列Asn-X-Ser/Thr內(nèi)所含的天冬酰胺殘基側(cè)鏈上的氨基上，其中X可以是除了脯氨酸之外 的任何氨基酸。最初的寡糖鏈通常在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被特定糖苷酶修剪，得到由兩個(gè)N-乙酰葡糖 胺和三個(gè)甘露糖殘基組成的短的分枝的核心寡糖。
[0009] 糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的最初處理后，通過小泡穿梭到高爾基體中，在那里寡糖鏈經(jīng) 歷進(jìn)一步的加工后被分泌到細(xì)胞表面。經(jīng)修剪的N-連接的寡糖鏈可以通過加入幾個(gè)甘露 糖殘基修飾，得到高甘露糖寡糖。備選地，N-乙酰葡糖胺的一個(gè)或多個(gè)單糖單位可以加入 核心甘露糖亞基形成復(fù)雜的寡糖。半乳糖可被加入N-乙酰葡糖胺亞基，唾液酸亞基可被加 入半乳糖亞基，得到以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺殘基的任一個(gè)結(jié)束的鏈。此外，巖藻 糖殘基可以加入核心寡糖的N-乙酰葡糖胺殘基。這些加入的每一種通過特定糖基轉(zhuǎn)移酶 催化。
[0010] 除了通過N-連接的糖基化途徑修飾外，糖蛋白也可通過向特定絲氨酸或蘇氨酸 殘基加入〇-連接的寡糖鏈被修飾，如它們在高爾基體中被處理那樣。〇-連接的寡糖的殘基 每次加入一個(gè)并且每個(gè)殘基的加入通過特定酶催化。〇-連接的糖基化的共有氨基酸序列不 如N-連接的糖基化意義明確。
[0011] 蛋白質(zhì)糖基化的最終質(zhì)量和程度受到細(xì)胞培養(yǎng)條件的顯著影響。例如，常規(guī)的分 批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法集中于所產(chǎn)生的肽的最終水平并且通常導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的糖蛋白，所 述糖蛋白具有較不廣泛的糖基化模式和/或這樣的糖基化模式，其寡糖鏈的糖殘基沒有足 夠地反映存在于天然發(fā)生形式的糖蛋白中的糖殘基。增加糖基化程度和/或調(diào)節(jié)糖殘基的 組成到更接近地反映存在于天然形式糖蛋白中的糖基化水平和組成可以潛在地導(dǎo)致這樣 的治療性糖蛋白物質(zhì)，其具有更高的功效、改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)和/或藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 和更少的副作用。盡管在提高細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的糖蛋白的糖基化的質(zhì)量和數(shù)量方面做出 了一定的努力，但是仍然需要額外的進(jìn)步。尤其需要開發(fā)通過在確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì) 胞產(chǎn)生具有改進(jìn)的糖基化模式的糖蛋白的系統(tǒng)。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本發(fā)明的方法和組合物提供了用于用細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模產(chǎn)生具有改進(jìn)的糖基化模 式的糖蛋白的改進(jìn)系統(tǒng)。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了商業(yè)規(guī)模（例如，500L或 更多）培養(yǎng)方法，其利用含有約10到600nM之間的錳的摩爾累積濃度的培養(yǎng)基。在一些實(shí) 施方案中，培養(yǎng)基中的摩爾累積谷氨酰胺濃度小于約8mM。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的 摩爾累積谷氨酰胺濃度小于約4mM。將理解如上面使用的"累積"指在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入 的具體一種或多種組分的總量，包括培養(yǎng)開始時(shí)加入的組分和隨后加入的組分。在本發(fā)明 的一些實(shí)施方案中，希望隨時(shí)間減小培養(yǎng)的"進(jìn)料"，因此希望最初存在的量最大。當(dāng)然，如 果那些組分在不同時(shí)間加入（例如，最初存在的所有組分對通過進(jìn)料加入的一些組分），那 么培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)期間被代謝使得具有相同累積量的給定組分的培養(yǎng)物將具有不同的 絕對水平。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，此類培養(yǎng)基的使用允許產(chǎn)生含有希望的糖基化模式的糖蛋白。在一 些實(shí)施方案中，糖蛋白可以具有更廣泛的糖基化模式和/或可以具有更類似于天然宿主細(xì) 胞應(yīng)用于該糖蛋白的寡糖鏈分布的寡糖鏈分布。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明系統(tǒng)的使用可 以導(dǎo)致產(chǎn)生這樣的糖蛋白，其糖基化模式與該糖蛋白在內(nèi)源人細(xì)胞中表達(dá)時(shí)將存在的糖基 化模式相似或相同。
[0015] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明的培養(yǎng)基制劑包括確定成分培養(yǎng)基和復(fù)雜的培養(yǎng) 基。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基，其中培養(yǎng)基的組成是已知的和受控的。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在美國臨時(shí)專利申請序號60/605, 097 (引入本文作為參 考）中所述的一個(gè)或多種條件下生長。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在美國臨時(shí)專利申請序號 11/213, 308 (引入本文作為參考）中所述的一個(gè)或多種條件下生長。
[0017] 本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物可以任選補(bǔ)充營養(yǎng)物和/或其他培養(yǎng)基組分，包括激素和/ 或其他生長因子、特定離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩沖劑、維生素、核苷或核苷 酸、微量元素（通常以極低終濃度存在的無機(jī)化合物）、氨基酸、脂類或葡萄糖或其他能源。 在一些實(shí)施方案中，對培養(yǎng)基補(bǔ)充化學(xué)誘導(dǎo)物如六亞甲基二（乙酰胺）（"HMBA"）和丁酸鈉 ("NaB"）可以是有益的。此類任選的補(bǔ)充物可以在培養(yǎng)開始時(shí)加入或者可以在以后的時(shí) 間點(diǎn)加入以便補(bǔ)充耗盡的營養(yǎng)物或者為了另一原因。通常，希望選擇最初的培養(yǎng)基組成以 便減小根據(jù)本發(fā)明的補(bǔ)充。
[0018] 附圖簡述
[0019] 圖1顯示了 UF/DF存留物質(zhì)中糖苷活性的研宄。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，代表多種 K4 和 K4' 種類的條形從左到右為：K4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、K4'（Fuc-GlcNAc-Gal)、 K4' （Fuc-GIcNAc)和 K4' （Fuc)。
[0020] 圖2顯示了在搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生的rFIX中K4種類分布。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，代表多 種 Κ4 和 Κ4' 種類的條形從左到右為：M(Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、Κ4'（Fuc-GlcNAc-Gal)、 Κ4' （Fuc-GIcNAc)和 Κ4' （Fuc)。
[0021] 圖3顯示了來自使用多種培養(yǎng)基添加劑的搖瓶培養(yǎng)物的Κ4種類分布。對 于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，代表多種Κ4和Κ4'種類的條形從左到右為：Κ4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、 Κ4' （Fuc-GlcNAc-Gal)、K4' （Fuc-GIcNAc)和 Κ4' （Fuc)。
[0022] 圖4顯示了使用補(bǔ)充培養(yǎng)基的搖瓶培養(yǎng)物的Κ4種類分布。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，代表 多種 Κ4 和 Κ4' 種類的條形從左到右為：Κ4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、Κ4'（Fuc-GlcNAc-Gal)、 Κ4' （Fuc-GIcNAc)和 Κ4' （Fuc)。
[0023] 圖5顯示了來自使用多種培養(yǎng)基添加劑的搖瓶培養(yǎng)物的Κ4種類分布。對 于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，代表多種Κ4和Κ4'種類的條形從左到右為：Κ4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、 Κ4' （Fuc-GlcNAc-Gal)、K4' （Fuc-GIcNAc)和 Κ4' （Fuc)。
[0024] 圖6顯示了來自不同錳水平下的搖瓶培養(yǎng)物的Κ4種類分布。對于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，代表 多種 Κ4 和 Κ4' 種類的條形從左到右為：Κ4 (Fuc-GlcNAc-Gal-SA)、Κ4'（Fuc-GlcNAc-Gal)、 Κ4' （Fuc-GIcNAc)和 Κ4' （Fuc)。
[0025] 圖7顯示了 G0、G1和G2HPAEC-PED峰的總峰面積百分?jǐn)?shù)的圖形比較。對于每個(gè)實(shí) 驗(yàn)，代表復(fù)雜N-連接的雙觸角聚糖的條形從左到右為：GO、Gl和G2。
[0026] 圖8顯示了 G0、G1和G2HPAEC-PED峰的總峰面積百分?jǐn)?shù)的圖形比較。對于每個(gè)實(shí) 驗(yàn)，代表復(fù)雜N-連接的雙觸角聚糖的條形從左到右為：GO、Gl和G2。
[0027] 定義
[0028] "氨基酸"：如本文所用的術(shù)語"氨基酸"指通常用于形成多肽的20種天然存在的 氨基酸的任一種，或者那些氨基酸的類似物或衍生物或任一種非天然存在的氨基酸。本發(fā) 明的氨基酸在培養(yǎng)基中提供給細(xì)胞培養(yǎng)物。培養(yǎng)基中提供的氨基酸可以作為鹽或者以水合 物形式提供。
[0029] "抗體":如本文所用的術(shù)語"抗體"指免疫球蛋白分子或者免疫球蛋白分子的免疫 學(xué)活性部分，即，含有特異結(jié)合抗原的抗原結(jié)合部位的分子，如Fab或F (ab'）2片段。在一些 實(shí)施方案中，抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的典型的天然抗體，如包含四條多肽鏈：兩條重鏈 和兩條輕鏈的糖蛋白。在一些實(shí)施方案中，抗體是單鏈抗體。例如，在一些實(shí)施方案中，單 鏈抗體包含典型的天然抗體的變體，其中重鏈和/或輕鏈的兩個(gè)或多個(gè)成員已經(jīng)例如通過 肽鍵共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，單鏈抗體是具有由重鏈和輕鏈組成的兩條多肽鏈結(jié)構(gòu) 的蛋白質(zhì)，所述鏈例如通過鏈間肽接頭穩(wěn)定化，所述蛋白質(zhì)具有特異結(jié)合抗原的能力。在一 些實(shí)施方案中，抗體是僅由重鏈組成的抗體，例如，在駝科（Camelidae)，包括羊駝和駱駝的 成員中天然發(fā)現(xiàn)的那些（見例如，Casterman等人的美國專利號6, 765, 087，Casterman等人 的美國專利號6, 015, 695和Casterman等人的美國專利號6, 005, 079,將它們各自完整引入 本文作為參考）。如本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"和"單克隆抗體組合物"指含有僅僅一 個(gè)種類的抗原結(jié)合部位并且因此通常僅與單個(gè)表位或特定抗原相互作用的一群抗體分子。 單克隆抗體組合物從而通常顯示出它們與之免疫反應(yīng)的特定表位的單一結(jié)合親和力。術(shù)語 "多克隆抗體"和"多克隆抗體組合物"指含有與特定抗原相互作用的多個(gè)種類的抗原結(jié)合 部位的抗體分子群體。
[0030] "分批培養(yǎng)"：如本文所用的術(shù)語"分批培養(yǎng)"指培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中在培養(yǎng)過程 開始時(shí)提供將最終用于培養(yǎng)細(xì)胞的所有組分，包括培養(yǎng)基（見下面"培養(yǎng)基"的定義）以及 細(xì)胞自身。分批培養(yǎng)通常在某個(gè)點(diǎn)停止并且收獲并任選純化培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或組分。
[0031] "生物反應(yīng)器":如本文所用的術(shù)語"生物反應(yīng)器"指用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物生長 的任何容器。生物反應(yīng)器可以為任何大小，只要它用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通常，此類生物 反應(yīng)器將為至少 1 升并且可以為 10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10, 000、12, 000 升或以上，或者之間的任何體積。在培養(yǎng)期間通?？刂粕锓磻?yīng)器的內(nèi)部條件，包括但不限 于，PH、溶解氧和溫度。生物反應(yīng)器可以由適于在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下容納懸浮在培養(yǎng)基中 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的任何材料（包括玻璃、塑料或金屬）組成。如本文所用的術(shù)語"生 產(chǎn)生物反應(yīng)器"指用于生產(chǎn)目的糖蛋白的最終生物反應(yīng)器。生產(chǎn)生物反應(yīng)器的體積通常為 至少500升并且可以為1000、2500、5000、8000、10, 000、12, 000升或以上，或之間的任何體 積。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道并且將能夠選擇用于實(shí)施本發(fā)明的合適的生物反應(yīng)器。
[0032] "細(xì)胞密度":如本文所用的術(shù)語"細(xì)胞密度"指在給定體積的培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞 數(shù)目。
[0033] "細(xì)胞生存力":如本文所用的術(shù)語"細(xì)胞生存力"指培養(yǎng)的細(xì)胞在給定的一組培養(yǎng) 條件或者實(shí)驗(yàn)變化下存活的能力。如本文所用的該術(shù)語也指特定時(shí)間存活的細(xì)胞相對于在 該時(shí)間時(shí)培養(yǎng)物中活細(xì)胞和死細(xì)胞總數(shù)的部分。
[0034] "復(fù)雜培養(yǎng)基":如本文所用的術(shù)語"復(fù)雜培養(yǎng)基"指含有身份或量未知或不受控制 的至少一種組分的培養(yǎng)基。
[0035] "培養(yǎng)物"、"細(xì)胞培養(yǎng)物":如本文所用的這些術(shù)語指在適于細(xì)胞群體存活和/或生 長的條件下懸浮在培養(yǎng)基（見下面"培養(yǎng)基"的定義）中的該細(xì)胞群體。如本領(lǐng)域技術(shù)人 員清楚的，在一些實(shí)施方案中，如本文所用的這些術(shù)語指包含細(xì)胞群體和其中懸浮該群體 的培養(yǎng)基的組合。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0036] "確定成分培養(yǎng)基"：如本文所用的術(shù)語"確定成分培養(yǎng)基"指這樣的培養(yǎng)基，其中 培養(yǎng)基的組成是已知的和受控的。
[0037] "補(bǔ)料分批培養(yǎng)":如本文所用的術(shù)語"補(bǔ)料分批培養(yǎng)"指培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中在 培養(yǎng)過程開始后一次或多次向培養(yǎng)物提供額外的組分。如此提供的組分通常包含在培養(yǎng)過 程期間被消耗的細(xì)胞的營養(yǎng)組分。額外或備選地，此類額外的組分可以包括補(bǔ)充組分（見 下面"補(bǔ)充組分"的定義）。在一些實(shí)施方案中，在補(bǔ)料培養(yǎng)基中提供額外的組分（見下面 的"補(bǔ)料培養(yǎng)基"）。補(bǔ)料分批培養(yǎng)通常在某點(diǎn)停止并且收獲并任選純化培養(yǎng)基中的細(xì)胞和 /或組分。
[0038] "補(bǔ)料培養(yǎng)基"：如本文所用的術(shù)語"補(bǔ)料培養(yǎng)基"指在細(xì)胞培養(yǎng)開始后加入的溶 液，其含有為哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長提供營養(yǎng)的營養(yǎng)物。補(bǔ)料培養(yǎng)基可以含有與最初的細(xì)胞培 養(yǎng)基中提供的組分相同的組分。備選地，補(bǔ)料培養(yǎng)基可以含有除了最初的細(xì)胞培養(yǎng)基中提 供的組分之外的一種或多種額外組分。額外或備選地，補(bǔ)料培養(yǎng)基可以缺少在最初的細(xì)胞 培養(yǎng)基中提供的一種或多種組分。在一些實(shí)施方案中，補(bǔ)料培養(yǎng)基的一種或多種組分以與 最初的細(xì)胞培養(yǎng)基中提供的那些組分的濃度或水平相同或相似的濃度或水平提供。在一些 實(shí)施方案中，補(bǔ)料培養(yǎng)基的一種或多種組分以與最初的細(xì)胞培養(yǎng)基中提供的那些組分的濃 度或水平不同的濃度或水平提供。示例性補(bǔ)料培養(yǎng)基在表2顯示，盡管本發(fā)明不限于使用 這些培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以使用備選的補(bǔ)料培養(yǎng)基和/或可以對表2中所 列的示例性補(bǔ)料培養(yǎng)基的組分進(jìn)行某些改變。在一些實(shí)施方案中，補(bǔ)料培養(yǎng)基含有補(bǔ)充組 分（見下面"補(bǔ)充組分"的定義）。
[0039] "片段":如本文所用的術(shù)語"片段"指被定義為給定多肽的任何離散部分的多肽， 所述離散部分是所述給定多肽獨(dú)特或特征性的。例如，如本文所用的該術(shù)語指給定多肽的 任一部分，其包括在全長多肽中發(fā)現(xiàn)的至少一個(gè)確定的序列元件。在一些片段中，序列元件 跨越全長多肽的至少4-5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或以上的氨基酸。備選或額外地， 如本文所用的該術(shù)語指給定多肽的保留全長多肽的至少一種活性的至少一部分的任何離 散部分。在一些實(shí)施方案中，所保留的活性的部分為全長多肽活性的至少10%。在一些實(shí) 施方案中，所保留的活性的部分為全長多肽活性的至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80 %或90 %。在一些實(shí)施方案中，所保留的活性的部分為全長多肽活性的至少95 %、96 %、 97%、98%或99%。在一些實(shí)施方案中，所述片段保留全長多肽活性的100%或以上。在一 些實(shí)施方案中，本發(fā)明的片段含有作為糖基化位點(diǎn)的肽序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的 片段含有糖基化位點(diǎn)的部分，使得當(dāng)連接到含有糖基化位點(diǎn)的另一部分的另一片段時(shí)，重 構(gòu)了功能糖基化位點(diǎn)。
[0040] "基因"：如本文所用的術(shù)語"基因"指任何核苷酸序列、DNA或RNA，其至少部分編 碼離散的終產(chǎn)物，通常是但不限于多肽，其在細(xì)胞代謝或發(fā)育的某方面發(fā)揮功能。任選地， 基因不僅包含編碼多肽或其他離散終產(chǎn)物的編碼序列，而且包含編碼區(qū)之前和/或之后的 調(diào)芐基礎(chǔ)表達(dá)水平的區(qū)域（見下面的"遺傳控制元件"的定義），和/或各編碼區(qū)段（"外 顯子"）之間的間插序列（"內(nèi)含子"）。
[0041] "遺傳控制元件":如本文所用的術(shù)語"遺傳控制元件"指任一序列元件，其調(diào)節(jié)它 有效連接的基因的表達(dá)。遺傳控制元件可以通過提高或降低表達(dá)水平發(fā)揮功能并且可以位 于編碼序列之前、之內(nèi)或之后。遺傳控制元件可以在基因表達(dá)的任一階段通過調(diào)節(jié)例如轉(zhuǎn) 錄的起始、延長或終止、mRNA剪接、mRNA編輯、mRN