一種Her-2基因的cDNA原位雜交探針及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子病理診斷領(lǐng)域，特別涉及一種Her-2基因的cDNA原位雜交探針及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人表皮生長(zhǎng)因子受體-2 (Epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是表 皮生長(zhǎng)因子受體EGFR家族的第二個(gè)成員，大約20%~30%的乳腺癌病例中存在Her-2基因 和/或HER-2蛋白水平增加，它是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子，在乳腺癌的靶向治療和預(yù)后判斷 中的作用已經(jīng)得到了全世界臨床醫(yī)生的認(rèn)可。Her-2基因陽(yáng)性腫瘤是一種高危腫瘤，Her-2 基因的擴(kuò)增預(yù)示病情進(jìn)展迅速，局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性高，化療緩解期短，無(wú)病生存期（Disease free survival, DFS)和總生存期（Overall Survival, OS)縮短，對(duì)某些常規(guī)的化療和激素 治療反應(yīng)性差?；贖er-2基因在乳腺癌診斷及治療中重要的指導(dǎo)意義，使用標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè) 手段和準(zhǔn)確的判別標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)乳腺癌樣本中Her-2基因的擴(kuò)增情況，對(duì)于評(píng)價(jià)預(yù)后、預(yù)測(cè)化 療與內(nèi)分泌治療效果及是否選擇赫賽汀治療具有指導(dǎo)意義。
[0003] 臨床上常用免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry, IHC)檢測(cè)HER-2受體蛋白 在腫瘤細(xì)胞表面的過(guò)表達(dá)，該方法簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、對(duì)材料的要求不高，是初步篩查的首選 方法。
[0004] 在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題：
[0005] 在進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)時(shí)，腫瘤細(xì)胞標(biāo)本在固定和處理過(guò)程中，其HER-2受 體蛋白容易受到破壞，HER-2受體蛋白受到破壞后，抗原會(huì)對(duì)此進(jìn)行修復(fù)，使得HER-2受體 蛋白的特異性會(huì)降低，進(jìn)而降低了免疫組織化學(xué)法檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)只能夠采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HER-2受體蛋白準(zhǔn)確性低的 問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種Her-2基因的cDNA原位雜交探針及其制備方法。所述技術(shù) 方案如下：
[0007] -方面，本發(fā)明提供了一種Her-2基因的cDNA原位雜交探針，所述探針的序列如 序列表中SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 另一方面，本發(fā)明提供了一種制備上述的探針的方法，所述方法包括：
[0009] 收集Her-2基因高表達(dá)的乳腺癌患者的新鮮腫瘤組織，提取所述腫瘤組織的總 mRNA，將所述總mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將所述cDNA與引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，所述 擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)度987bp的Her-2基因片段，即為所述探針的片段，構(gòu)建含有所述Her-2基因 的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒。將所述質(zhì)粒作為模板，并利用所述引物和羅氏的聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)地高辛探針合成試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記，得到所述探針；其中，所述引物包括：
[0010] 上游引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示，下游引物的序列如序列表中SEQ ID NO. 3 所示。
[0011] 進(jìn)一步地，所述構(gòu)建含有所述Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒的方 式為：將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，得到凝膠產(chǎn)物，并在所述凝膠產(chǎn)物上切取所需目的產(chǎn)物條 帶，并對(duì)所述目的產(chǎn)物條帶進(jìn)行回收，得到回收的所述擴(kuò)增產(chǎn)物，再將所述回收的擴(kuò)增產(chǎn)物 連接至PUM-T載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，挑取陽(yáng)性克隆，所述陽(yáng)性克隆即為所述 含有Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒。
[0012] 具體地，所述擴(kuò)增程序?yàn)椋?br>[0013] (1)95 ? 3 分鐘；
[0014] (2)%。〇3〇 秒；
[0015] (3)58。〇3〇 秒；
[0016] (4)72°C30 秒；
[0017] (5)重復(fù)步驟（2)- (4) 30個(gè)循環(huán)；
[0018] (6) 72°C 10 分鐘。
[0019] 具體地，所述擴(kuò)增的反應(yīng)液為：所述模板1μ 1，所述上游引物1μ 1，所述下游引 物 1μ 1，dNTPly l，10Xbuffer2. 5μ 1，MgCl22y 1，rTaq酶0· 5μ 1，蒸餾水 16μ 1，總體積 25 μ 1。
[0020] 進(jìn)一步地，所述電泳時(shí)采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠。
[0021] 進(jìn)一步地，所述方法還包括：在所述挑取陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序。
[0022] 進(jìn)一步地，采用RNA裂解液提取所述總mRNA。
[0023] 進(jìn)一步地，利用定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所述總mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0024] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本發(fā)明對(duì)乳腺癌患者腫瘤組織 進(jìn)行取材、切片，通過(guò)羅氏的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)地高辛探針合成試劑盒標(biāo)記的探針與組織中 Her-2基因的DNA發(fā)生特異性的結(jié)合，從而方便、準(zhǔn)確的觀察到組織中Her-2基因 DNA水平 的變化，本發(fā)明使用的Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列，對(duì)Her-2基因 DNA的顯示有 明確的特異性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Her-2基因 DNA水平擴(kuò)增情況的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一 步地詳細(xì)描述。
[0026] 實(shí)施例
[0027] 1.弓丨物的設(shè)計(jì)
[0028] 根據(jù)Her-2基因的Gene bank序列設(shè)計(jì)了 Her-2基因特異性的引物，引物序列 為：上游引物：5' -AGGAGTGCGTGGAGGAAT-3'，如序列表中SEQ ID NO. 2所示；下游引物： 5' -CCAGCCCGAAGTCTGTAAT-3'，如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示。
[0029] 2.制備含有Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒
[0030] (1)收集60例Her-2基因高表達(dá)的乳腺癌患者的新鮮腫瘤組織（60例患者來(lái)自武 漢市六醫(yī)院，自2011年2月至2013年6月），利用RNA裂解液（Trizol法)提取該腫瘤組織的 總mRNA，將提取出的總mRNA利用定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Quanti Tect Reverse Transcription Kit)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ;
[0031] (2)將該CDNA用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)度 987bp的Her-2基因片段，即為探針的片段；
[0032] 其中，擴(kuò)增的程序?yàn)椋?br>[0033] (1)95 ? 3 分鐘；
[0034] (2) 95? 30 秒；
[0035] (3) 58? 30 秒；
[0036] (4)72°C30 秒；
[0037] (5)重復(fù)步驟（2)- (4) 30個(gè)循環(huán)；
[0038] (6) 72°C 10 分鐘。
[0039] 擴(kuò)增的反應(yīng)液為：
[0040] 所述模板1 μ 1，所述上游引物1 μ 1，所述下游引物1 μ 1，dNTPl μ 1， 10父1311打6^.5 4 1，]\%(：122 4 1，1^39酶0.5 4 1，蒸餾水16 4 1，總體積25 4 1。
[0041] (3)將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，參照DNA Marker切取位置在凝膠產(chǎn)物 上的987bp處的條帶切取所需目的產(chǎn)物條帶；
[0042] (4)將切取的目的產(chǎn)物條帶，用膠回收試劑盒進(jìn)行回收，得到回收的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0043] (5)將該回收的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pUM-T載體上，得到連接后的質(zhì)粒；
[0044] (6)將連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ci中，挑取陽(yáng)性克隆，該陽(yáng)性克隆即為含 有所述Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒。
[0045] (7)在挑取陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序。
[0046] 3.標(biāo)記Her-2基因的cDNA原位雜交探針
[0047] (1)測(cè)序正確后，經(jīng)判斷Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列插入載體的順序是 正向的，該探針的序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0048] (2)少量培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，提取含有Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒；
[0049] (3)以含有Her-2基因的cDNA原位雜交探針序列的質(zhì)粒為模板，利用上述引物和 羅氏的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)地高辛探針合成試劑盒（PCR DIG Probe SynthesisKit)進(jìn)行探針 記。
[0050] 4. Her-2基因的cDNA原位雜交探針的顯色原位雜交檢測(cè)
[0051] (1)收集上述60例Her-2基因高表達(dá)的乳腺癌患者的新鮮腫瘤組織標(biāo)本；
[0052] (2) 60例標(biāo)本分別用中性福爾馬林液固定24~48小時(shí)后再用石蠟包埋、連續(xù)切片 4張，每張厚度4~5 μ m，室溫（23°C ±2°C )干燥后60°C烤片2~4小時(shí)；
[0053] (3)二甲苯脫蠟兩次，每次5分鐘(未指明溫度處均為室溫環(huán)境）；
[0054] (4)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的酒精洗滌3次，每次洗滌3分鐘；
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