從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種腺苷化學(xué)對照品的制備方法，尤其涉及從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃綠蜜環(huán)菌(Ar?i77aria 7wiec^rivens)，俗名黃蘑葫，為野生大宗高原真菌，具有抗流感、防治神經(jīng)炎、腳氣病、促進(jìn)兒童發(fā)育、抗氧化及抗腫瘤等作用，所含的核苷和甾醇類成分為其主要活性成分。迄今，黃綠蜜環(huán)菌并未有質(zhì)控指標(biāo)成分。腺苷是黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體中含量較高的核苷類化合物，由于該化合物極性較大，從子實(shí)體中獲取高純度腺苷對照品較為困難。為了加快黃綠蜜環(huán)菌的質(zhì)量評價(jià)、生產(chǎn)銷售及相關(guān)新藥的研發(fā)步伐，發(fā)展高純度腺苷的高效制備方法，尤其規(guī)?；苽浼夹g(shù)顯得尤為重要。
[0003]目前，從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體制備核苷類化合物的文獻(xiàn)未見報(bào)道，艾鳳偉，郭文娟，張偉等報(bào)道從白附子，內(nèi)生真菌及天麻中采用萃取，結(jié)晶及反復(fù)柱層析等手段獲取純度90%以上的腺苷(艾鳳偉，張嵩，李艷鳳，等.白附子的化學(xué)成分研宄，中草藥，2010，41 (2):201-203 ;郭文娟，郭順星.潛在抗HIV活性內(nèi)生真菌Epulorhiza sp.的化學(xué)成分研宄，中草藥，41 (11):1773-1775 ;張偉，宋啟示.貴州大方林下栽培天麻的化學(xué)成分研宄，中草藥，2010，41 (11):1782-1785)。其中硅膠柱層析次數(shù)至少3~5次，過程繁瑣且重結(jié)晶損失量較大(回收率較少)，而且規(guī)模化純化制備腺苷的研宄未見文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種工藝簡單、易規(guī)?；膹狞S綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明所述的從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法，包括以下步驟:
⑴醇沉除雜:
黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體水提物用其質(zhì)量5~10倍的水溶解后，采用體積分?jǐn)?shù)60~95%的乙醇溶液進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾得到濾液A，該濾液A經(jīng)減壓干燥得棕黃色浸膏；
⑵微孔樹脂柱富集:
所述棕黃色浸膏用其質(zhì)量5~10倍的體積分?jǐn)?shù)5~20%的乙醇溶液溶解，濾紙過濾，得到濾液B ;該濾液B上微孔樹脂柱分離后，依次用2~5倍柱體積的水、20%~35%乙醇溶液、50%乙醇溶液進(jìn)行臺階梯度洗脫，收集50%乙醇水洗脫物，該洗脫物減壓干燥，即得腺苷粗品；所述棕黃色浸膏與所述微孔樹脂比例為I g:10 mL;
⑶反相液相制備色譜精制:
所述腺苷粗品用其質(zhì)量2~5倍的體積分?jǐn)?shù)為30~80%的甲醇溶液溶解，然后配制樣品濃度為60.0-150.0 mg/mL，經(jīng)0.45 μπι微孔濾膜過濾，得到濾液C ;該濾液C采用高效反相液相制備色譜柱進(jìn)行分離，經(jīng)檢測波長為254 nm的紫外檢測器檢測，收集制備色譜圖中主要的色譜峰餾分，該色譜峰餾分經(jīng)減壓干燥即可得白色粉末狀的腺苷對照品。
[0006]所述步驟⑴、所述步驟⑵和所述步驟⑶中的減壓干燥的條件均是指真空度為0.06-0.09 MPa,溫度為 50-70 °C。
[0007]所述步驟⑶中制備液相色譜的工作參數(shù)是指色譜柱柱長250 mm、直徑20 mm，反相制備柱固定相為耐純水C18或常用C18，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)2~10%的乙腈-水溶液或5~20%的甲醇水溶液，進(jìn)樣體積為5.0 mL，流速為20 mL/min。
[0008]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明采用醇沉處理，可直接將黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體水提物中脂溶性成分和水溶性成分(多糖、蛋白等生物大分子)分開。
[0009]2、本發(fā)明采用微孔樹脂柱富集腺苷，可獲取含量約為70%~80%的(HPLC歸一化法)的腺苷粗品，同時(shí)，微孔樹脂具有良好的脫色效果。另外微孔樹脂柱可以再生循環(huán)使用，平均價(jià)格低廉。
[0010]3、本發(fā)明采用反相高效液相制備，可獲取高純度對照品，且收率較高(>90%) O
[0011]4、本發(fā)明原料要求不高，一般市售黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體即可，易于批量備料。
[0012]5、本發(fā)明工藝簡單、易于操作，采用本發(fā)明方法可快速制備純度大于98%的腺苷對照品，制備規(guī)模為克級到百克級，非常適宜規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說明】
[0013]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0014]圖1為本發(fā)明醇沉后腺苷的HPLC代表性分析圖譜(254 nm)。
[0015]圖2為本發(fā)明微孔樹脂柱富集后腺苷的HPLC代表性分析圖譜(254 nm)。
[0016]圖3為本發(fā)明腺苷粗品的高效液相色譜分析及制備代表性圖譜(254nm)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1 從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法，包括以下步驟:
⑴醇沉除雜:
100 g黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體水提物(棕黑色固體)用其質(zhì)量5倍的水溶解后，采用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾得到濾液A，該濾液A經(jīng)真空度為0.06 MPa、溫度為70°〇減壓干燥得棕黃色浸霄25.20 go
[0018]⑵微孔樹脂(MCI)柱富集:
棕黃色浸膏用其質(zhì)量5倍的體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液溶解，濾紙過濾，得到濾液B ;該濾液B上微孔樹脂(MCI)柱分離后，依次用5倍柱體積的水、20%乙醇溶液、50%乙醇溶液進(jìn)行臺階梯度洗脫，收集50%乙醇水洗脫物，該洗脫物減壓干燥即得1.80 g腺苷粗品。
[0019]其中:棕黃色浸膏與微孔樹脂比例為I g:10 mL。
[0020]減壓干燥的條件是指真空度為0.06 MPa,溫度為70 V。
[0021]⑶反相液相制備色譜精制:
腺苷粗品用其質(zhì)量2倍的體積分?jǐn)?shù)為40%的甲醇溶液溶解，然后配制樣品濃度為100.0mg/mL,經(jīng)0.45 μπι微孔濾膜過濾，得到濾液C ;該濾液C采用柱長250 mm、直徑20 mm的高效反相液相制備色譜柱進(jìn)行分離，經(jīng)檢測波長為254 nm的紫外檢測器檢測，收集制備色譜圖中主要的色譜峰餾分，該色譜峰餾分經(jīng)真空度為0.06 MPa、溫度為70 °0減壓干燥即可得到純度大于98%的白色粉末狀的腺苷對照品1.62 go收率約為90.0%。
[0022]其中:制備色譜柱的填料為10 μπι耐純水C18 (Megress);進(jìn)樣體積為5.0 mL，采用的流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇水溶液，流速為20 mL/min。
[0023]實(shí)施例2 從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法，包括以下步驟:
⑴醇沉除雜:
10 g黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體水提物(棕黑色固體)用其質(zhì)量10倍的水溶解后，采用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾得到濾液A，該濾液A經(jīng)真空度為0.09 MPa、溫度為50°C減壓干燥得棕黃色浸膏1.82 go
[0024]⑵微孔樹脂(MCI)柱富集:
棕黃色浸膏用其質(zhì)量10倍的體積分?jǐn)?shù)5%的乙醇溶液溶解，濾紙過濾，得到濾液B ;該濾液B上微孔樹脂(MCI)柱分離后，依次用2倍柱體積的水、30%乙醇溶液、50%乙醇溶液進(jìn)行臺階梯度洗脫，收集50%乙醇水洗脫物，該洗脫物減壓干燥即得140.2 mg腺苷粗品。
[0025]其中:棕黃色浸膏與微孔樹脂比例為I g:10 mL。
[0026]減壓干燥的條件是指真空度為0.09 MPa,溫度為50 V。
[0027]⑶反相液相制備色譜精制:
腺苷粗品用其質(zhì)量5倍的體積分?jǐn)?shù)為30%的甲醇溶液溶解，然后配制樣品濃度為60.0mg/mL,經(jīng)0.45 μπι微孔濾膜過濾，得到濾液C ;該濾液C采用柱長250 mm、直徑20 mm的高效反相液相制備色譜柱進(jìn)行分離，經(jīng)檢測波長為254 nm的紫外檢測器檢測，收集制備色譜圖中主要的色譜峰餾分，該色譜峰餾分經(jīng)真空度為0.09 MPa、溫度為50 °0減壓干燥即可得到純度大于98%的白色粉末狀的腺苷對照品126.9 mg ο收率約為90.5%。
[0028]其中:制備色譜柱的填料為10 μπι常用C18 (Innovol);進(jìn)樣體積為5.0 mL，采用的流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醇水溶液，流速為20 mL/min。
[0029]實(shí)施例3 從黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體規(guī)?；苽湎佘栈瘜W(xué)對照品的方法，包括以下步驟:
⑴醇沉除雜:
200 g黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體水提物(棕黑色固體)用其質(zhì)量7倍的水溶解后，采用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液進(jìn)行醇沉，經(jīng)過濾得到濾液A，該濾液A經(jīng)真空度為0.07MPa、溫度為60°〇減壓干燥得棕黃色浸膏48.52 go
[0030]⑵微孔樹脂(MCI)柱富集:
棕黃色浸膏用其質(zhì)量7倍的體積分?jǐn)?shù)10%的乙醇溶液溶解，濾紙過濾，得到濾液B ;該濾液B上微孔樹脂(MCI)柱分離后，依次用3倍柱體積的水、25%乙醇溶液、50%乙醇溶液進(jìn)行臺階梯度洗脫，收集50%乙醇水洗脫物，該洗脫物減壓干燥即得3.84 g腺苷粗品。