一種定向合成化合物clcn及其在抗肝癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種定向合成化合物CLCN，本發(fā)明還進(jìn)一步提供了該化合物在抗肝 癌藥物中的應(yīng)用，屬于涉及醫(yī)藥合成技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們?nèi)粘?說的肝癌指的多是原發(fā)性肝癌。肝癌的初期癥狀并不明顯，而晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散使其 治愈率較低。手術(shù)是治療肝癌的常用方法，但是大部分患者并不適合該方法，而非手術(shù)的治 療方式臨床上效果也并不理想。近年來，中藥復(fù)方及天然化合物的抗腫瘤活性成為研宄熱 點(diǎn)，因此，科研工作者期望能夠以此為契機(jī)找到更加安全有效的抗肝癌特效藥物以彌補(bǔ)目 前治療方式的不足。
[0003] 甘草素（Cordyc印in)又稱蟲草菌素，是冬蟲夏草中主要活性成分，也是第一個(gè)從 真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用。自 1997年發(fā)現(xiàn)甘草素具有特殊的選擇性殺死白血病癌細(xì)胞的作用以來，由美國國家癌癥研宄 所波士頓醫(yī)學(xué)中心（BMC)和OXIGEN公司合作，由甘草素制成的治療白血病的新藥已進(jìn)入 第三期臨床實(shí)驗(yàn)。甘草素的抗腫瘤活性成為藥理學(xué)中一個(gè)極其活躍的研宄領(lǐng)域。細(xì)胞實(shí) 驗(yàn)中甘草素通過調(diào)控B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2 ;Bcl-2)、多聚腺苷二磷酸 核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase ;PARP )、細(xì)胞色素 C (Cytochrome C; Cyto C)以及Caspase家族等相關(guān)蛋白，成功誘導(dǎo)人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-BE⑵-C)、黑色素 瘤細(xì)胞（SK-MEL-2 cells)及乳腺癌細(xì)胞（MCF-7)凋亡；此外，抑制絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)活性也是促 MCF-7 凋亡的主要因素。
[0004] 甘草素（Liquiritigenin)是一種存在于甘草中的二氫黃酮單體化合物，具有抗 炎、保肝等生理活性。關(guān)于甘草素抗腫瘤的報(bào)道主要源自南京醫(yī)科大學(xué)課題組以及本課題 組。甘草素可有效抑制人肝癌細(xì)胞（SMMC-7721)以及宮頸癌細(xì)胞（Hela)增殖并誘導(dǎo)凋亡。 經(jīng)體內(nèi)研宄發(fā)現(xiàn)，甘草素能延長H22荷瘤小鼠的生存時(shí)間，并能抑制瘤體增生及誘導(dǎo)腫瘤 組織細(xì)胞凋亡。南京醫(yī)科大學(xué)近期的研宄表明，甘草素通過調(diào)控AKT/mT0R-p70S6K信號(hào)通 路抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞血管生成相關(guān)因子VEGF和HIF-Ia的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開一種定向合成化合物CLCN，是一種以植物單體為原料定向合成的新化 合物，具有抗肝癌效果顯著、見效快、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了定向合成化合物CLCN的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明還提供CLCN在制備抗肝癌藥物中的用途，及制備而得的抗肝癌藥物。
[0008] 本發(fā)明所述的一種定向合成化合物CLCN，具有以下結(jié)構(gòu)式：
其化學(xué)名稱為：CLCN ;分子式為：C26H2505N5;相對分子量為：487. 64。
[0009] 本發(fā)明所述的定向合成化合物CLCN的合成方法，以甘草素和甘草素為原料定向 合成，包括以下步驟： ①將2-6 mg甘草素溶于3-6mL二氯甲烷溶液中，加入1-2 mL四溴化碳，然后在冰浴 中緩慢滴加1-2 mL三苯基磷的二氯甲烷溶液，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液過濾，濾液濃縮后通過 硅膠柱層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結(jié)晶得到反應(yīng)物A。
[0010] ②以反應(yīng)物A與KOH作為反應(yīng)物(原料比為I :1-1 :2)，5-10 mL四氫呋喃作為溶 劑，70-90°C回流溫度下攪拌4-8h，反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，加入對甲基苯磺酰氯反應(yīng)6h， 收集反應(yīng)液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑四氫呋喃，加水溶解后過濾收集濾渣，干燥結(jié)晶，得到 反應(yīng)物B。
[0011] ③以反應(yīng)物B和蟲草素為原料(原料比為I :1-1 :1. 5)，1等當(dāng)量的CuI為催化劑， 以20 mL二甲基甲酰胺溶液或鄰二氯苯溶液中任意一種或兩種為溶劑，在30-45°C回流溫 度條件下攪拌6-12h，反應(yīng)完畢后將全部反應(yīng)液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石油 醚：氯仿-2:3)濃縮結(jié)晶得到反應(yīng)物C。
[0012] ④將反應(yīng)物C與KOH原料(原料比為1 :1-1 :1. 5)，10 mL DMSO作為反應(yīng)物，10 mL 四氫呋喃作為溶劑，加熱回流4-8h，反應(yīng)完畢后將全部反應(yīng)液過濾，濾液濃縮后通過硅膠 柱層析（石油醚：氯仿-2:3)濃縮結(jié)晶得到目標(biāo)產(chǎn)物CLCN。
[0013] 本發(fā)明化合物作為藥效活性成分可以制備成的抗肝癌的藥劑，所述藥劑為片劑， 膠囊，溶液，懸浮液，注射液或滴注液等醫(yī)藥學(xué)上的任何藥物劑型。
[0014] 【用法用量】給藥劑量為每天0. 5mg-500mg/kg體重，給藥方式為口服，滴注或注射； 給藥對象為哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物包括人。
[0015] 通過以下體內(nèi)和體外兩個(gè)方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證本發(fā)明CLCN的抗肝癌效果，并從分 子機(jī)制上給出相關(guān)依據(jù) 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面： 采用人肝癌細(xì)胞系（HepG2和PLC/PRF/5 )作為體外細(xì)胞模型，考察CLCN對肝癌細(xì)胞生 長的影響。通過MTT實(shí)驗(yàn)獲得CLCN對H印G2或PLC/PRF/5細(xì)胞的半數(shù)致死濃度（IC50)，以 此濃度為基礎(chǔ)選擇后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用劑量。CLCN或磷酸鹽緩沖液（PBS)處理人肝癌細(xì)胞12小 時(shí)及24小時(shí)后，利用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡（Annexin V/PI雙染)、細(xì)胞周期（PI單染法） 以及胞內(nèi)ROS含量（2'，7' -二氯熒光素二乙酸酯染色法)的變化；CLCN或PBS處理人肝癌細(xì) 胞24小時(shí)后，蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot)檢測細(xì)胞裂解液中Caspase3以及PARP活性改 變，應(yīng)用乳酸脫氫酶（LDH)試劑盒檢測培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的釋放情況，利用激光共聚焦 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變（H 〇echst33342染色);CLCN處理人肝癌細(xì)胞12天，結(jié)晶紫染色 觀察CLCN對人肝癌細(xì)胞增殖的影響。證實(shí)CLCN具有較好的抑制肝癌細(xì)胞生長、促肝癌細(xì) 胞凋亡的藥效。CLCN處理人肝癌細(xì)胞系（PLC/PRF/5和H印G2) 0. 5-24小時(shí)，利用Western Blot實(shí)驗(yàn)考察ERKs、JNK、P38、和mTOR在不同時(shí)間點(diǎn)磷酸化活性變化；為CLCN抗肝癌效果 提供了分子理論依據(jù)。
[0016]、體外實(shí)驗(yàn)方面： 建立了異位腫瘤小鼠模型，根據(jù)移植部位，腫瘤模型可分為原位腫瘤模型和異位腫瘤 模型。
[0017] 本法明中將PLC/PRF/5肺癌細(xì)胞注射于免疫缺陷小鼠背側(cè)皮下，成功建立異位腫 瘤模型。通過腹腔給藥CLCN-段時(shí)間后，和對照組小鼠的腫瘤大小相比對，驗(yàn)證了 CLCN的 抗肝癌效果。
[0018] 本法明提供的CLCN制備抗肝癌藥物的用途，所制備而得的抗肝癌藥物，可以基于 制藥領(lǐng)域的技術(shù)人員的常識(shí)而加入不影響藥物藥效的輔助成分，如載體，賦型劑等。由于該 藥物通過口服、注射、皮下包埋等方式均可見效，因此，劑型可以是多樣的。
[0019] 本法明提供的抗肝癌藥物還可以是混合有其它與CLCN配合使用對治療肝癌有積 極作用的藥物成分。
[0020] 本法明提供的CLCN制備抗肝癌藥物的用途，所制備而得的抗肝癌藥物，本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以加入穩(wěn)定劑，只要不影響CLCN藥效的發(fā)揮，所得的抗肝癌藥物均在本法明要求 保護(hù)的范圍內(nèi)在專利法允許的范圍內(nèi)，本法明還要求保護(hù)CLCN在抗肝癌治療中的用途，在 動(dòng)物模型試驗(yàn)中達(dá)到抗肝癌治療效果的劑量范圍是〇. 5mg-500mg/kg。
[0021] 本發(fā)明的積極效果在于： 通過甘草素和甘草素為原料定向合成新產(chǎn)物CLCN，相比于植物原料單體來講對抗肝癌 具有更明顯的醫(yī)療效果，并且合成工藝比較簡單，成本較低，有利于工業(yè)化成產(chǎn)。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明CLCN對肝癌細(xì)胞PLC/PRL/5和!fepG2存活率的影響；豎坐標(biāo)：細(xì)胞 存活率；橫坐標(biāo)：不同劑量CLCN，從左到右梯度增加； 圖2為本發(fā)明CLCN對小鼠腫瘤生長的抑制作用； 圖3為本發(fā)明CLCN對肺癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響；A圖：CLCN對肺癌細(xì)胞PLC/ PRL/5中凋亡相關(guān)蛋白的影響；B圖：CLCN對肺癌細(xì)胞H印G2中凋亡相關(guān)蛋白的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步具體說明，但本發(fā)明的范圍不限于以下實(shí)施例。
[0024] 實(shí)施例1 稱取5mg甘草素溶于5mL二氯甲烷溶液中，加入2mL四溴化碳，然后在冰浴中緩慢滴加 2mL三苯基磷的二氯甲烷溶液，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液過濾，濾液濃縮后通過硅膠柱層析（石 油醚：氯仿-2:3)濃縮結(jié)晶得到反應(yīng)物A，收率為87. 8%。稱取2mg反應(yīng)物A與9mg Κ0Η，將 其置于干燥的圓底燒瓶中，加入IOmL四氫呋喃，90°C條件下回流8h，反應(yīng)完畢后冷卻至室 溫，加入對20mL甲基苯磺酰氯反應(yīng)6h，收集反應(yīng)液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去反應(yīng)溶劑四氫呋喃，加水 溶解后過濾收集濾渣，干燥結(jié)晶，得到反應(yīng)物B。收率為88. 7%。稱取IOmg反應(yīng)物B與18mg 蟲草素，將其置于干燥的圓底燒瓶中，加入1等當(dāng)量的CuI為催化劑，加入20mL二甲基甲 酰胺溶液，在30°C條件下回流10h，反應(yīng)完畢后將全部反應(yīng)液過濾，濾