表達(dá)豬瘟病毒e2蛋白的重組偽狂犬病病毒變異株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及偽狂犬病病毒變異株，尤其涉及表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組偽狂犬 病病毒變異株，本發(fā)明還涉及所述重組偽狂犬病病毒變異株在制備預(yù)防或治療豬瘟和/或 偽狂犬病的疫苗或試劑中的用途，屬于偽狂犬病病毒變異株的構(gòu)建及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟（Classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床上主要以高熱稽留、廣泛性出 血和高死亡率為主要特征（Moennig，2000)。豬瘟被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)列入OIE疫病 名錄（OIE-listed diseases)，為須申報(bào)的（notifiable)動(dòng)物性傳染病，在中國CSF被列為 "一類動(dòng)物疫病"。該病呈世界范圍內(nèi)流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 偽狂犬?。≒seudorabies，PR)又稱奧耶茨基氏病，是由偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)引起的豬、羊、牛等多種家畜及野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢 (豬除外）、腦脊髓炎、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性傳染?。∕ettenleiter et al. , 2008) 〇
[0004] 在PRV基因中缺失一個(gè)或多個(gè)病毒復(fù)制非必需基因，可以使病毒毒力減弱，但同 時(shí)又不影響自身的增殖和免疫原性，這樣以PRV作為載體攜帶其他外源抗原基因進(jìn)入生 物體內(nèi)，不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)PRV的免疫反應(yīng)，同時(shí)也可以產(chǎn)生對(duì)外源抗原的免疫 應(yīng)答。因此，這些基因缺失的PRV常常用來作為載體來表達(dá)外源基因，從而構(gòu)建多價(jià)疫 苗（路明華，路迎迎，王宏俊.偽狂犬病病毒載體疫苗研宄進(jìn)展.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2013 ; 34(6) : 136-140)。因此，開發(fā)一種安全有效的預(yù)防或治療豬瘟和/或偽狂犬病的新型PRV 病毒活載體多價(jià)疫苗極具應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組偽狂犬病病 毒變異株，該變異株穩(wěn)定性好，外源蛋白表達(dá)水平高，具有良好的安全性和免疫原性，能夠 用于制備預(yù)防或治療豬瘟和/或偽狂犬病的疫苗或試劑。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明以分離的偽狂犬病流行毒株（TJ株）構(gòu)建了 gE/gl雙基因缺失的重 組病毒rPRVTJ-delgE/gl，以此為基礎(chǔ)，以CSFV強(qiáng)毒Shimen株E2蛋白為模式抗原，在 rPRVTJ-delgE/gl中插入CSFV的主要保護(hù)性抗原E2基因，并對(duì)所獲得的重組病毒進(jìn)行了進(jìn) 一步的克隆，篩選出一株復(fù)制特性好、穩(wěn)定性好、外源蛋白表達(dá)量高的重組偽狂犬病病毒變 異株 rPRVTJ-delgE/gI-E2。
[0008] 本發(fā)明將獲得的重組偽狂犬病病毒變異株rPRVTJ-delgE/gI-E2提交專利認(rèn)可的 機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC No. 10411 ;分類命名為：表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白 的重組變異株偽狂犬病病毒。保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心； 保藏時(shí)間是2015年03月19日；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué) 院微生物研宄所。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了所述表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組偽狂犬病病毒變異株的構(gòu) 建方法，包括以下步驟：（1)構(gòu)建含有豬瘟病毒E2基因的轉(zhuǎn)移載體；（2)將經(jīng)酶切處理的重 組病毒rPRVTJ-delgE/gl-EGFP-Neo基因組和步驟（1)構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，收 獲病毒，篩選，純化，即得。
[0010] 本發(fā)明以特異引物對(duì)分別擴(kuò)增CMV片段和CSFV E2片段，再經(jīng)融合PCR獲得 CMV-E2片段。然后將CMV-E2片段克隆至pOK-LR載體上，獲得轉(zhuǎn)移載體p0K-LR-CMV-E2。 本發(fā)明進(jìn)一步將經(jīng)酶切處理（經(jīng)Pac I和Pme I雙酶切處理）的重組病毒rPRVTJ-delgE/ gl-EGFP-Neo基因組和p0K-LR-CMV-E2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)物，反復(fù)凍 融后，取上清接種PK-15細(xì)胞，進(jìn)行蝕斑篩選，挑取有細(xì)胞病變但不發(fā)綠色熒光的蝕斑。進(jìn) 一步對(duì)獲得的重組病毒進(jìn)行蝕斑純化，隨機(jī)挑取10個(gè)克隆，對(duì)每個(gè)克隆連續(xù)傳20代后， 經(jīng)PCR鑒定，豬瘟病毒E2蛋白基因仍然存在于所有病毒株的基因組中，對(duì)每個(gè)毒株所擴(kuò)增 的E2基因測序結(jié)果均與理論序列一致，說明外源基因可以穩(wěn)定存在于重組病毒中。IFA結(jié) 果顯示，重組病毒不同克隆株接種PK-15細(xì)胞后都能夠表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白，在蛋白表 達(dá)量上不同毒株之間有一定的差異。流式細(xì)胞儀分析不同病毒株表達(dá)蛋白的平均熒光強(qiáng) 度，結(jié)果顯示，有一株病毒表達(dá)外源蛋白的熒光強(qiáng)度要明顯高于其它毒株（P〈〇. 05)，命名為 rPRVTJ-delgE/gI-E2〇
[0011] 本發(fā)明將CMV啟動(dòng)子置于E2基因的上游，而沒有使用PRV本身的啟動(dòng)子，這大大 能夠增加外源蛋白的表達(dá)量。在構(gòu)建方法上，采用了指示病毒反向篩選與引入單一酶切位 點(diǎn)相結(jié)合的方法，大大加快了重組病毒的獲得與純化。本發(fā)明經(jīng)過6輪的蝕斑篩選就獲得 了目的病毒。
[0012] Western blot分析顯示，重組病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2插入的外源片段CSFV E2 基因能夠正確的進(jìn)行表達(dá)。一步生長曲線繪制結(jié)果顯示，重組病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2與 親本毒PRV TJ株的一步生長曲線走勢基本相符，說明外源片段CSFV E2的插入對(duì)病毒本身 的增殖無影響；但重組病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的滴度比親本病毒PRV TJ株低約101.75， 在接毒后l〇_16h二者病毒滴度具有顯著性差異（p〈0. 05)。
[0013] 本發(fā)明重組病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2能夠應(yīng)用于制備預(yù)防或治療豬瘟和/或偽 狂犬病的疫苗或試劑。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種預(yù)防或治療豬瘟和/或偽狂犬病的疫苗組合物，包括： 免疫有效量的表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組偽狂犬病病毒變異株rPRVTJ-delgE/gI-E2和藥 學(xué)上可接受的佐劑。
[0015] 對(duì)靶動(dòng)物豬的致病性及免疫原性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2 具有良好的安全性和免疫原性，免疫仔豬后能夠?qū)RV及CSFV的攻擊提供完全的保護(hù)。
[0016] rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫豬針對(duì)PRV TJ株的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：免疫后6d， 不同劑量的rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫組個(gè)別豬PRV gB抗體轉(zhuǎn)為陽性，攻毒后gB抗體滴 度迅速升高，至攻毒后6d達(dá)到較高的水平，隨后gB抗體水平趨于平穩(wěn)。PRV gE抗體檢測 結(jié)果顯示，對(duì)于不同劑量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫豬，僅IO4TCID 5tl免疫組有2頭豬于攻毒 后15d才發(fā)生gE抗體陽轉(zhuǎn)，其它劑量免疫豬均沒有產(chǎn)生gE抗體。在攻毒后6d，不同劑量 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫豬檢測到了針對(duì)PRV TJ株的中和抗體的產(chǎn)生，隨后逐漸升高，高 劑量免疫豬的中和抗體滴度要高于低劑量免疫組。攻擊PRV TJ株后，rPRVTJ-delgE/gI-E2 不同劑量免疫豬均沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀，僅104TCID50rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫組有1 頭豬出現(xiàn)排毒。
[0017] rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫豬針對(duì)CSFV的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以不同劑量的 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫仔豬后，最高劑量（IO6TCID5ci) -次免疫組于免疫后4w有2頭豬 CSFV特異性抗體轉(zhuǎn)陽，至攻毒前該組所有豬的豬瘟抗體均發(fā)生陽轉(zhuǎn)；rPRVTJ-delgE/gI-E2 兩次免疫組（1〇 5或10 4TCID5tl免疫組）于加強(qiáng)免疫后CSFV特異性抗體逐漸升高，攻毒后所 有免疫豬抗體迅速上升，并于攻毒后9d達(dá)到峰值，抗體阻斷率達(dá)到80 %左右。攻毒后免 疫豬產(chǎn)生的CSFV中和抗體迅速上升，于攻毒后9d達(dá)到較高水平。CSFV攻擊后，不同劑量 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫組所有豬均沒有出現(xiàn)發(fā)熱及豬瘟特異性的臨床癥狀，均沒有檢測 到CSFV核酸的存在。對(duì)存活豬進(jìn)行剖檢和病理解剖學(xué)觀察，不同劑量免疫豬均沒有出現(xiàn)明 顯的病理變化，而PBS對(duì)照組出現(xiàn)明顯的豬瘟特征性病變。
[0018] 在對(duì)CSFV的攻毒保護(hù)評(píng)價(jià)上，rPRVTJ-delgE/gI-E2以IO6TCID 5tl劑量一次免疫或 以IO5TCID5tl或10 4TCID5tl劑量兩次免疫即可對(duì)CSFV強(qiáng)毒的攻擊提供完全的攻毒保護(hù)，即使 在攻毒之前沒有檢測到豬瘟特異性的抗體或抗體滴度較低的豬在攻擊CSFV之后也沒有出 現(xiàn)任何臨床反應(yīng)和病理變化，而且在攻毒之后豬瘟特異性抗體迅速上升，提示產(chǎn)生了免疫 記憶反應(yīng)。宄其原因可能與非特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)，有研宄顯示，PRV作為疫苗載體 構(gòu)建的重組病毒免疫動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)非常強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，這對(duì)抵抗病毒的攻擊也起到 非常重要