CRISPR/Cas9和Cre/lox系統(tǒng)編輯偽狂犬病毒基因組制備疫苗方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地指一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和 Cre/lox重組系統(tǒng)編輯偽狂犬病毒基因組快速制備疫苗的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病毒是α -皰瘆病毒成員，基因組由DNA雙鏈組成。偽狂犬病毒能誘發(fā)多 種家畜和野生動物的急性傳染病，引起發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎等癥狀 [1]。該病毒的天然宿主 是豬，且能感染各年齡段豬，是危害我國和世界生豬養(yǎng)殖業(yè)最重要的病原之一。疫苗接種是 偽狂犬病最有效的防控手段，目前市面上有多種商業(yè)化的偽狂犬病毒疫苗一一弱毒疫苗、 滅活疫苗和多基因缺失活疫苗。其中多基因缺失活疫苗較之其他疫苗更高效更安全，因此 得到了更廣泛的應(yīng)用。陳煥春等構(gòu)建的TK/gG雙基因缺失疫苗 [2]、郭萬柱等構(gòu)建的TK/gE/ gl三基因缺失疫苗[4]，在近二十年來有效控制了偽狂犬病在我國的流行，為提高生豬養(yǎng)殖 業(yè)的效益做出了巨大貢獻。
[0003] 而近三年來，偽狂犬病又有卷土重來的態(tài)勢，先后在華北華中多個地區(qū)省份繼續(xù) 發(fā)生和流行，已有初步的研宄表明，與以往毒株相比，新的毒株的抗原性發(fā)生變異，且對仔 豬有更強的致病力 [11，12]。由此可見，偽狂犬病毒的變異也是該病防控工作中需要面臨的一 大突出問題，因此在研發(fā)出能徹底根治偽狂犬病的特效藥物之前，建立一種高效快捷的偽 狂犬病毒多基因缺失活疫苗的構(gòu)建方法，是有效防控變異偽狂犬病毒更大范圍流行和減少 重大經(jīng)濟損失的有力保證。
[0004] Cas9蛋白是一種DNA內(nèi)切酶，能在引導(dǎo)RNA的引導(dǎo)下結(jié)合到與引導(dǎo)RNA互補配對 的DNA序列位點，并發(fā)揮DNA內(nèi)切活性，切斷DNA雙鏈。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種高效的 基因編輯技術(shù)，被science和nature評為2013年科學(xué)十大進展之一 [1°]，但在醫(yī)療臨床實 踐和農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)等方面，特別是在預(yù)防獸醫(yī)領(lǐng)域還未得到實質(zhì)應(yīng)用。目前這項技術(shù)在多個 物種上都有了相關(guān)研宄 [5'6'7]，而其針對偽狂犬病毒這種與人類經(jīng)濟活動息息相關(guān)的高傳染 性和強致病力的病毒病原，能否發(fā)揮多基因敲入的功能，還未有相關(guān)報道。
[0005] Cre重組酶蛋白同時具有DNA內(nèi)切酶和重組酶活性，能特異性識別幾種34bp的反 向重復(fù)的Iox序列，如ΙοχΡ、ΙοχΝ、1οχ2272等 [9]。若同種同向的一對Iox片段分別位于目 的基因兩端，Cre酶可以將成對Iox序列之間的目的基因和其中一個Iox序列切除 [8]。利 用這種特性，將一種（或多種）同向成對的Iox序列放到一個（或多個）外源篩選基因兩 端，敲入到病毒的一個（或多個）毒力基因位點，完成目的毒力基因的條件性敲除之后，可 以再用Cre重組酶高效切除外源篩選基因得到一個（或多個）基因缺失毒株 [3]。然而由于 缺乏有力的基因敲入工具，Cre/lox系統(tǒng)作為一種高效的基因敲除工具并沒能在病毒疫苗 的制備中得到廣泛應(yīng)用。也沒有利用Cre/lox系統(tǒng)來一步實現(xiàn)多基因敲除，以制備多基因 缺失疫苗的報道。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題就是提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和 Cre/lox重組系統(tǒng)編輯偽狂犬病毒基因組快速制備疫苗的方法及其應(yīng)用。
[0020] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和Cre/ Iox重組系統(tǒng)編輯偽狂犬病毒基因組快速制備疫苗的方法，包括以下步驟：
[0021] 1)根據(jù)偽狂犬病毒目的基因基因序列設(shè)計用于特異性靶向目的基因的SgRNA ;再 在目的基因的sgRNA的基礎(chǔ)上設(shè)計SgRNA雙鏈寡聚核苷酸序列；
[0022] 2)將目的基因的sgRNA雙鏈寡聚核苷酸與線性化的質(zhì)粒載體連接，轉(zhuǎn)化提取得到 目的基因的sgRNA表達載體；
[0023] 3)靶向偽狂犬病毒目的基因的外源篩選基因同源重組片段的構(gòu)建；
[0024] a、體外擴增偽狂犬病毒目的基因上游同源臂hml和下游同源臂hm2,純化；
[0025] b、體外擴增外源篩選基因，并將擴增外源篩選基因插入含有同向成對的Iox序列 的線性化的載體內(nèi)；
[0026] c、PCR體外擴增得到Iox-外源篩選基因-Iox片段，再進行融合PCR擴增得到 hml-lox-外源篩選基因-lox_hm2片段；
[0027] 4)按磷酸鈣轉(zhuǎn)染法或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將hml-lox-外源篩選基因-l〇X_hm2片段 與目的基因的SgRNA表達載體混合轉(zhuǎn)染，得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
[0028] 5)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染偽狂犬病毒野毒株，得到偽狂犬病毒多基因重組病毒，并純化。
[0029] 6)按磷酸鈣轉(zhuǎn)染法或者脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將Cre/lox系統(tǒng)表達質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，得到 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
[0030] 7)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞感染偽狂犬病毒多基因重組病毒，得到偽狂犬病毒多基因缺失病 毒，純化得到偽狂犬病毒多基因缺失疫苗株。
[0031] 進一步地，所述步驟1)中，SgRNA在目的基因上的靶序列符合5' -GN(20)GG、 5' -GN(18)GG、5' -GN(17)GG、5' -N(21)GG、5' -N(20)GG 或者 5' -N(19)GG 的序列排列規(guī)則。
[0032] 再進一步地，所述步驟1)中，設(shè)計sgRNA雙鏈寡聚核苷酸序列在其正向寡核苷酸 Forward oligo 5'端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5'端加上AAA，設(shè)計得 到一對引物：
[0033] Forward oligo :5' -CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN;
[0034] Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5? 〇
[0035] 再進一步地，所述步驟步驟3)中，第b小步中，Iox序列為34bp的反向重復(fù)的Iox 序列，Iox序列為loxP、IoxN和1οχ2272中任意一種。
[0036] 本發(fā)明還提供了一種利用上述方法制備缺失gE基因和TK基因的偽狂犬雙基因編 輯病毒疫苗株，包括以下步驟：
[0037] 1)分離和純化野生型偽狂犬病毒；
[0038] 2)偽狂犬病毒gE基因和TK基因 sgRNA的設(shè)計；分別在gE基因和TK基因上選擇 符合 5' -GN(20)GG、5' -GN(18)GG、5' -GN(17)GG、5' -N(21)GG、5' -N(20)GG 或者 5' -N(19) GG的序列規(guī)則的位點；通過BLAST工具比對確定gE-sgRNA(SEQ ID NO. I)和TK-sgRNA(SEQ ID NO. 2)的序列；
[0039] 3)將gE-sgRNA雙鏈寡核苷酸和TK-sgR