一種能特異性檢測輪狀病毒的核酸適體及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種能特異性檢測輪狀病毒的核酸適體及試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 輪狀病毒是全球嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉病最常見的病原體之一，其主要感染小腸上皮細(xì) 胞，從而造成細(xì)胞損傷，引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季流行，感染途徑為糞一口途徑， 臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎，呈滲透性腹瀉病，病程一般為7天，發(fā)熱持續(xù)3天，嘔吐2~3天， 腹瀉5天，嚴(yán)重出現(xiàn)脫水癥狀。
[0003] 輪狀病毒總共有七種，分別以英文字母編號為A、B、C、D、E、F與G等。人類主要是 受到輪狀病毒A種、B種與C種的感染，而其中最常見的是輪狀病毒A種的感染。而這七種 輪狀病毒都會在其他動物身上造成疾病。
[0004] 在輪狀病毒A種之中有不同的病毒株，稱之為血清變異株（serovar)。與流行性 感冒病毒類似，輪狀病毒使用了雙重的分類系統(tǒng)，依據(jù)病毒體表面的兩個結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)來 作分類的。糖蛋白VP7定義了 G型。而對于蛋白酶敏感的蛋白質(zhì)VP4則定義了 P型。P型 會以一個數(shù)字來標(biāo)示出P血清型，并用方括弧內(nèi)部的一個數(shù)字來標(biāo)示所對應(yīng)的P基因型。G 血清型的表示方法也很類似，但是G基因型的數(shù)字會與G血清型的數(shù)字相同。舉個例來說， "輪狀病毒W(wǎng)a病毒株"（rotavirus strain Wa)就會被標(biāo)示成"P1A[8]G1"。因為這兩個決 定G型跟P型的基因可以被分開傳送而產(chǎn)生后代，所以兩基因不同的組合就會產(chǎn)生各種不 同的病毒株。
[0005] 輪狀病毒在世界各地均有分布，A、B、C組輪狀病毒能引起人類和動物腹瀉，D-G組 只引起動物腹瀉。A組主要流行的血清型為G1P8、G2P4、G3P8和G4P8,在所有就診病例中占 到80%以上。年長兒童和成人常呈無癥狀感染，通常稱病毒攜帶者。無論在發(fā)達(dá)或發(fā)展中 國家，A組RV引起的腹瀉都有較高的發(fā)病率，是嬰幼兒發(fā)病和致死的重要病因。在發(fā)展中國 家，為嬰幼兒致死的僅次于呼吸道感染的第二位病因。糞-口是RV傳播的主要途徑，此外 水源污染，呼吸道空氣傳播，院內(nèi)和幼托所及家庭成員中的密切接觸均可造成流行，還有人 推測，動物可能是作為人感染RV的重要傳染源。病毒侵入人體后在小腸粘膜絨毛細(xì)胞內(nèi)增 殖，病毒外殼蛋白VP4為主要致病因子，它造成細(xì)胞溶解死亡，微絨毛萎縮、變短、脫落；腺 窩細(xì)胞增生、分泌增多，導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉，水和電解質(zhì)的喪失。病毒的潛伏期只有一到兩天，然 后突然發(fā)燒、水樣腹瀉、嘔吐脫水，憑自身免疫可完全恢復(fù)。但當(dāng)嬰兒營養(yǎng)不良或已有脫水， 若不及時治療，就會導(dǎo)致嬰兒死亡。由于病毒本身變異較大，針對性疫苗難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化， 世界衛(wèi)生組織（WHO)推薦以預(yù)防為主，注意嬰幼兒營養(yǎng)和衛(wèi)生狀況來達(dá)到降低病毒的感染 率。
[0006] 傳統(tǒng)檢測RV感染的方法主要依賴于電鏡（EM)或免疫學(xué)測定，如酶聯(lián)免疫吸附 (ELlSA)等等。近年隨著分子遺傳學(xué)等的發(fā)展，建立了更為特異和敏感的檢測方法，如RNA 核酸雜交，RT-PCR等用于檢測核酸的方法。
[0007] 核酸適體（Aptamer，又稱適配體，適配子）是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物革El標(biāo)的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適 體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子識別 功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有很多 優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速的穿 透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生 物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種能特異性檢測輪狀病毒的核酸適體及試劑盒。
[0009] 本發(fā)明提供的核酸適體，是如下（a)或（b):
[0010] (a)序列表的序列1所示的單鏈DNA ;
[0011] (b)序列表的序列2所示的單鏈DNA。
[0012] 所述核酸適體與輪狀病毒VP4蛋白具有較好的親和能力。
[0013] 還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0014] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：
[0015] a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具 有相同功能的核酸適體的衍生物；
[0016] b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同 功能的核酸適體的衍生物；
[0017] c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物；
[0018] d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的 衍生物；
[0019] e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體 具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0020] 固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板（如96孔板）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可采用 酶聯(lián)放大法檢測待測樣本中的輪狀病毒VP4蛋白，從而實現(xiàn)臨床中輪狀病毒的檢測。
[0021] 所述核酸適體可用于制備檢測輪狀病毒的試劑盒。
[0022] 本發(fā)明還保護(hù)一種輔助檢測輪狀病毒患者的試劑盒，包括所述核酸適體。所述試 劑盒還可包括包被有輪狀病毒VP4蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板（如96孔板）。所述包被有輪 狀病毒VP4蛋白單克隆抗體的酶標(biāo)板具體可為具有肝炎病毒VP4蛋白單克隆抗體的96孔 板。利用本發(fā)明的核酸適體，可以在輪狀病毒感染初期，通過檢測輪狀病毒VP4抗原而不是 抗體實現(xiàn)對輪狀病毒的檢測。本發(fā)明的核酸適體將有利發(fā)展輪狀病毒檢測的新方法。
[0023] 本發(fā)明還保護(hù)固定有所述核酸適體的酶標(biāo)板在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒 可以輔助檢測輪狀病毒VP4蛋白和/或輔助檢測輪狀病毒患者。
[0024] 利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲溶液中的輪狀病毒VP4蛋白，也可以檢測溶液 中的輪狀病毒，將有利于輪狀病毒血清學(xué)診斷和血液篩查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代 替單克隆抗體捕獲VP4蛋白進(jìn)行輪狀病毒檢測，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu) 點。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價值。
【具體實施方式】
[0025] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0026] Nl-NTA瓊脂糖微珠購自Qlagen公司。鏈霉親和素修飾的96孔板（購于pierce 公司）。辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素購自pierce公司。大腸桿菌（E. coll) DH5a菌株購自北京鼎國公司。大腸桿菌（E.coll)BL21(DE3)菌株購自Invltrogen公 司。原核表達(dá)載體PLMl ;公眾可以從中國科學(xué)院化學(xué)研宄所獲得；參考文獻(xiàn)：SodeokaM， Larson C，Chen L, et al. A multifunctional plasmid for protelnexpresslonby ECPCR ! overproduction of the p50subunlt of NF-k B. B loorg Med ChemLett. 1993， 3 ：1089_1094〇
[0027] 實施例1、相關(guān)蛋白和相關(guān)溶液的制備
[0028] -、帶組氨酸標(biāo)簽的輪狀病毒VP4蛋白（靶標(biāo)蛋白）的制備
[0029] I、VP4蛋白的編碼基因的擴增
[0030] VP4蛋白的序列是本領(lǐng)域已經(jīng)公知的。如：Genbank :SEG_DQ005115S。
[0031] 以輪狀病毒，特別是A病毒為模板，作為PCR擴增的模板，用引物1和引物2組成 的引物對進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0032] 引物 1 (上游引物）：5' -atggc ttcgctcatt tataga-3' ；
[0033] 引物 2 (下游引物）：5,-tcacagtttacactgcagtat-3' ；
[0034] 上、下游引物的5'端分別引入EcoRl酶切位點和BamHl酶切位點。
[0035] PCR 擴增條件：95°C 2mln ;95°C 30s，66°C 30s，72°C lmln，35 個循環(huán)；72°C 7mln。
[0036] 2、原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037] ①用限制性酶EcoRl和BamHl雙酶切步驟I的PCR擴增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物。
[0038] ②用限制性酶EcoRl和BamHl雙酶切原核表達(dá)載體pLMl，回收載體骨架。
[0039] ③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。
[0040] ④將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素（Amp)的LB平板 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒依次進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。
[0041] 測序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pLMl-VP4 (骨架質(zhì)粒為原核表達(dá)載體pLMl，在 EcoRl和BamHl酶切識別位點之間插入了輪狀病毒VP4蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸 標(biāo)簽的編碼基因融合，表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的輪狀病毒VP4蛋白）。
[0042] 3、帶組氣酸標(biāo)簽的輪狀病毒VP4蛋白的原核表達(dá)鑒定
[0043] ①將重組質(zhì)粒PLM1-VP4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的 LB平板篩選陽性克隆。
[0044]