②挑取陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基，37°C振搖過夜，加入1PTG(終濃度lmmol/L)繼 續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)IOh。
[0045] ③ 13000rpm 離心 lmln，收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳和 Western blot。 Westernblot的一抗為antl-hls (購自Slgma公司）。Western blot的結(jié)果表明，菌體中含 有帶組氨酸標(biāo)簽的輪狀病毒VP4蛋白。
[0046] 4、帶組氨酸標(biāo)簽的輪狀病毒VP4蛋白的大量表達(dá)、純化及檢測
[0047] ①將重組質(zhì)粒pLMl-VP4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌。
[0048] ②將步驟①得到的重組菌接種LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，按1 : 50的體積比 轉(zhuǎn)接到含50ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)約2h (使0D600為0. 6-0. 8)， 加入1PTG(終濃度lmmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)12h。
[0049] ③3500rpm離心收集菌體，在含100ug/ml溶菌酶的start buffer (0· 02M磷酸鈉， 0. 5M NaCl，pH7. 4)中超聲破碎（頻率120w，每個(gè)循環(huán)內(nèi)超聲3s停3s，400個(gè)循環(huán)，在冰浴 上進(jìn)行），4°C、1000 Orpm離心lOmln，收集裂解上清。
[0050] ④將裂解上清上樣于Nl-NTA偶聯(lián)的瓊脂糖黏附柱（購自GE公司），用 washlngbuffer (0. 02M 磷酸鈉，0. 5M NaCl，0. 05M 咪唑，P H7 · 4)洗滌去除雜蛋白，用 elutlonbuffer(0· 02M磷酸鈉，0· 5M NaCl，0. 5M咪唑，ρΗ7· 4)洗脫目的蛋白，得到帶組氨酸 標(biāo)簽的輪狀病毒VP4蛋白（用輪狀病毒VP4抗原檢測試劑盒檢測為陽性）。
[0051] 實(shí)施例2、核酸適體的篩選和制備
[0052] -、蛋白的固定
[0053] 1、取Nl-NTA瓊脂糖微珠置于5ml離心管中，移走上清，PBS緩沖液洗滌三次；
[0054] 2、將步驟1的微珠分散于靶標(biāo)蛋白（或?qū)φ盏鞍诪榇竽c桿菌空載體蛋白）中，室 溫孵育Ih，PBS緩沖液離心洗滌三次；
[0055] 3、將步驟2的微珠重新分散于Iml PBS緩沖液中，置于4°C備用。
[0056] 二、隨機(jī)核酸文庫的設(shè)計(jì)
[0057] 設(shè)計(jì)兩端包含大約20個(gè)核苷酸、中間包括40個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下：
[0058] 5 ' -ATGCTCGGATCGCACTAAAGG (MO) ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3 ' ；N40 代表 40 個(gè)隨機(jī) 核苷酸。
[0059] 三、核酸適體的篩選
[0060] UDNA文庫預(yù)處理
[0061] 將隨機(jī)核酸文庫溶于結(jié)合緩沖液中。
[0062] 2、反篩
[0063] 將隨機(jī)核酸文庫與固定有對照蛋白的微珠混合，37°C孵育1-2小時(shí)；經(jīng)結(jié)合緩沖 液洗滌后，將微珠通過超濾離心。
[0064] 3、正篩
[0065] 將反篩過程中超濾離心的溶液加入固定有靶標(biāo)蛋白的微珠中，37°C孵育1-2小 時(shí)。將微珠通過超濾離心洗滌后，用滅菌水將微珠轉(zhuǎn)移到離心管中。將微珠經(jīng)95°C加熱 10mln、冰上冷卻10mln、高速離心后，收集上清液并以其中的DNA為模板，利用引物（F1TC- 擴(kuò)增后通過親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，然后利用0. 2M的氫氧化鈉 使雙鏈DNA變性解鏈，收集FlTC標(biāo)記的DNA單鏈，這些DNA單鏈脫鹽后用于下一輪篩選。
[0066] 為了獲得高親和性和特異性結(jié)合靶標(biāo)蛋白的核酸適體，在篩選的過程中逐步改變 反篩和正篩的蛋白量、篩選時(shí)間、含量以及正篩洗滌次數(shù)，以增加篩選壓力。
[0067] 10輪篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過引物（5' -ATGCTCGGATCGCACTAAAGG-3'和 5' -CGCATGAAAACGTCCAGCAT-3,）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序。
[0068] 最終選擇的核酸適體序列如下（見序列表的序列1和2):
[0069] 序列 I (LZBD-I) :ATGCTCGGATCGCACTAAAGGATACGCTCCAATTACCAGCTTACCACCTACGAC AGATCTC ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3,；
[0070] 序列 2 (LZBD-2) :ATGCTCGGATCGCACTAAAGGAGATCTTACATTCAATCGCCTATACATACTATC CGCTATG ATGCTGGACGTTTTCATGCG-3' ；
[0071] 實(shí)施例3、核酸適體的特異性（通過熒光素檢測）
[0072] -、核酸適體的FlTC標(biāo)記
[0073] 用異硫氰酸熒光素（FlTC)標(biāo)記實(shí)施例2制備的核酸適體LZBD-I和LZBD-2。
[0074] 二、核酸適體的特異性
[0075] 1、蛋白的固定
[0076] (1)靶標(biāo)蛋白的固定
[0077] ①取200ul Nl-NTA瓊脂糖微珠置于5ml離心管中，移走上清，PBS緩沖液洗滌三 次；
[0078] ②將步驟①的微珠分散于ImL靶標(biāo)蛋白中，室溫孵育lh，PBS緩沖液離心洗滌三 次；
[0079] ③將步驟①的微珠重新分散于Iml PBS緩沖液中，置于4°C備用。
[0080] ⑵對照蛋白的固定
[0081] 用對照蛋白代替靶標(biāo)蛋白，其它同步驟（1)。其中所述對照蛋白分別為輪狀病毒 VP6蛋白、VP2蛋白、BSA、人血紅蛋白、流感HA蛋白，gpl20蛋白。
[0082] 2、核酸適體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合的特異性
[0083] 設(shè)置以下3組處理：
[0084] 第1組：將Iul IOuM FITC標(biāo)記的核酸適體LZBD-I用結(jié)合緩沖液溶解，與50ul固 定有靶標(biāo)蛋白的微珠孵育Ih ;
[0085] 第2組：將Iul IOuM FITC標(biāo)記的核酸適體LZBD-2用結(jié)合緩沖液溶解，與50ul固 定有靶標(biāo)蛋白的微珠孵育Ih ;
[0086] 第3組：將Iul IOuM FITC標(biāo)記的隨機(jī)文庫用結(jié)合緩沖液溶解，與50ul固定有靶 標(biāo)蛋白的微珠孵育Ih ;
[0087] 第4-9組：將Iul IOuM FITC標(biāo)記的核酸適體LZBD-I用結(jié)合緩沖液溶解，與50ul 分別固定有6種對照蛋白的微珠孵育Ih ;
[0088] 第10-15組：將Iul IOuM FITC標(biāo)記的核酸適體LZBD-2用結(jié)合緩沖液溶解，與 50ul分別固定有6種對照蛋白的微珠孵育Ih ;
[0089] 各組均在剛剛加入微珠的時(shí)刻（結(jié)合前）和孵育1小時(shí)的時(shí)刻（結(jié)合后）取上清 液，測量熒光強(qiáng)度。
[0090] 結(jié)合率=(結(jié)合前熒光強(qiáng)度-結(jié)合后清液熒光強(qiáng)度）/結(jié)合前熒光強(qiáng)度X 100%。
[0091]

[0092] 結(jié)果表明：核酸適體LZBD-I和LZBD-2對靶標(biāo)蚩白具有很好的特異性。核酸適體 LZBD-I和LZBD-2與對照蛋白均不能結(jié)合，表現(xiàn)出較好的特異性。隨機(jī)文庫的適體也不能與 靶標(biāo)蛋白結(jié)合。
[0093] 另外通過常規(guī)的結(jié)合性試驗(yàn)，得出其解離常數(shù)Kd分別為LZBD-I為15nM，LZBD-2 為 12nM。
[0094] 實(shí)施例4、采用核酸適體板檢測血清中的輪狀病毒
[0095] 取SOul含有輪狀病毒的血清；與結(jié)合緩沖液等體積混合，加入到核酸適體板， 200ul每孔，37°C孵育1小時(shí)（1-2小時(shí)均可）；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入HRP修飾的輪狀病毒 VP4蛋白單克隆抗體，37°C孵育0. 5小時(shí)（0. 5-1小時(shí)均可）；經(jīng)洗滌液洗滌后，加入顯色液 A+B，顯色10分鐘；設(shè)置對照。
[0096] 顯色后檢測450nm下的光吸收值。計(jì)算核酸適體板的相對吸光強(qiáng)度。結(jié)果表明，核 酸適體LZBD-I和核酸適體LZBD-I可以檢測血清中的靶標(biāo)病毒。通過PCR檢驗(yàn)病毒滴度， 發(fā)現(xiàn)采用適體檢測的效果反而強(qiáng)于PCR檢測的方法。
[0097] 實(shí)施例5穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0098] 將核酸適體LZBD-I和核酸適體LZBD-2分別置于常溫的血清中，3周后，通過PCR 檢測其殘留量，發(fā)現(xiàn)仍然有90%保持活性?；钚詸z測發(fā)現(xiàn)，其活性基本沒有變化。說明，該 適體具有較好的穩(wěn)定性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 核酸適體，其特征在于：能與病毒特異性結(jié)合。2. 如權(quán)利要求1所述的核酸適體，其特征在于：能與輪狀病毒特異性結(jié)合。3. 如權(quán)利要求2所述的核酸適體，其特征在于：其序列為序列表的序列1所示的單鏈 DNA;或序列表的序列2所示的單鏈DNA。4. 一種輪狀病毒特異性檢測試劑盒，其含有權(quán)利要求1-3所述的核酸適體。5. 權(quán)利要求1-3所述核酸適體在制備用于檢測輪狀病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能特異性檢測輪狀病毒的核酸適體及試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體SEQ ID No.1-2，與輪狀病毒VP4蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲溶液中的輪狀病毒，也可以檢測溶液中輪狀病毒的VP4蛋白，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將有利于輪狀病毒血清學(xué)診斷和血液篩查。利用本發(fā)明的核酸適體進(jìn)行輪狀病毒檢測，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12R1/93, C12N15/115, C12Q1/68, C12Q1/70
【公開號】CN104894136
【申請?zhí)枴緾N201510284321
【發(fā)明人】劉慧 , 蔣玉紅, 張璐
【申請人】劉慧
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月23日