一種提高番茄抗氧化能力的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種提高番茄果實抗氧化能力的基因 片段及其具體應(yīng)用方法，該片段的基因序列物SEQ ID NO :1所示，可以賦予植物更多的積累 類黃酮包括蘆丁、山奈酚蕓香苷等，以及咖啡酰奎尼酸等物質(zhì)，并提高番茄抗氧化能力。
【背景技術(shù)】
[0002] 類黃酮（Flavonoids)，指兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接的一 系列化合物。自然界分布廣泛，常以游離態(tài)或糖苷的形式存在于高等植物及羊齒植物的根、 莖、葉、花、果實，是許多中草藥的有效成分（Graf et al·，2005; Hertog et al·，1995)。 不同的類黃酮類化合物在植物中具有不同的生物學(xué)功能，通常被分為黃酮類、黃酮醇類、黃 酮酮類、兒茶精類、異黃酮類、花青素類。由于廣泛存在于植物中，生理活性多樣，近年來引 起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、飼料、化工等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價值。
[0003] 類黃酮是一類天然的植物次生代謝產(chǎn)物，對人類健康起到促進(jìn)作用，并且可以減 少一些疾病的風(fēng)險。作為抗氧化劑、自由基清除劑和二價陽離子鰲合劑，可以抗菌消炎， 抗癌以及抑制血小板凝集（Simona et al·，2010; Zhen et al·，2010)，每天定量食用 類黃酮可以降低7-31%的癌癥發(fā)生率，30-40%的心臟病發(fā)生率（（Hertog et al.，1993; Soobrattee et al. , 2006)〇
[0004] 類黃酮也作為信號分子、植物抗毒素和化感物質(zhì)在植物與微生物相互作用中發(fā)揮 作用（Mol et al·，1998; Harborne et al·，2000; Pietta, 2000; Winkel-Shirley, 2001)，花青素類物質(zhì)還影響著植物的顏色(唐傳核，2005)等。類黃酮的生物活性大體概括 為以下幾個方面：（1)抗氧化和清除自由基作用；（2)抑菌和抗病毒作用；（3)抗炎和抗過 敏作用。
[0005] 咖啡?？崴幔–affeoyl quinic acid)是一類由奎尼酸和不同數(shù)目咖啡酸通過 酯化反應(yīng)綜合而成的酚酸類天然化合物，主要存在于茄科植物，以及咖啡，蘋果，及梨中。近 20年來，國內(nèi)外學(xué)者就咖啡?？崴岬闹参锘瘜W(xué)和藥理學(xué)進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)這類化合 物具有一些重要的生物活性，極具臨床價值。
[0006] 綠原酸（Chlorogenic acid),是由咖啡酸（Caffeic acid)與奎尼酸（Quinic acid，1-羥基六氫沒食子酸)生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生 的一種苯丙素類化合物。根據(jù)咖啡酰在奎尼酸上的數(shù)目不同，從理論上講，可分為一咖啡 ?？崴?，二咖啡?？崴岷腿Х弱？崴?，根據(jù)咖啡酰在奎尼酸上的位置不同，又存在 許多異構(gòu)體。
[0007] 在人體中，綠原酸主要直接被小腸吸收（Williamson et al·，2000)，限制低密度 脂肪的氧化從而降低動脈粥樣硬化的可能性，通過清除烷基過氧自由基降低體內(nèi)毒性，組 織DNA破壞從而防止癌癥發(fā)生（Sawa et al.，1999)。據(jù)報道，綠原酸的主要生物活性有 (1)對透明質(zhì)酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；（2)對自由基的清除及抗脂質(zhì)過氧化作 用；（3)抗誘變作用；（4)保肝利膽作用；（5)抗菌、抗病毒及解痙等作用。
[0008] 目前主要通過常規(guī)手段利用天然材料(銀杏葉、洋蔥、檸檬、各種中藥材等）為基礎(chǔ) 的化學(xué)方法獲得，受到原材料來源不足、含量偏低、初提物成份復(fù)雜及相關(guān)藥理毒性不清等 因素的嚴(yán)重限制，由少數(shù)公司控制下游產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售，價格居高不下。
[0009] 目前廣泛種植的番茄僅含有少量的類黃酮和咖啡酰奎尼酸。利用番茄作為生物反 應(yīng)器生產(chǎn)植物疫苗、化合物等正成為基因工程研究的一個熱點。番茄是重要的轉(zhuǎn)基因受體 植物，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄葉盤轉(zhuǎn)化法從報道之后一直得到廣泛應(yīng)用。但是如何能夠提高番 茄體內(nèi)類黃酮和咖啡酰奎尼酸的含量，進(jìn)而提高番茄果實抗氧化能力一直是現(xiàn)有常規(guī)技術(shù) 無法解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種可以賦予番茄強(qiáng)抗氧化能 力的DNA片段。
[0011] 發(fā)明人首先提供了一種包含也基因的DNA片段，其也基因的基因 序列如SEQ ID NO :1所示，上述DNA片段具有提高番茄果實抗氧化能力的作用。
[0012] 本發(fā)明的發(fā)明人首先通過特異引物也F1，其基因序列如SEQ ID NO :2所 示，和也R1，其基因序列如SEQ ID N0:3所示，采用現(xiàn)有技術(shù)高保真擴(kuò)增全長 招Μλ. 7基因，獲得基因序列如SEQ ID NO :1所示的基因片段。
[0013] 之后發(fā)明人通過特異引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示，和E8PR1，其基 因序列如SEQ ID NO :5所示，以番茄品種中蔬4號基因組DNA為模版，組合擴(kuò)增出編碼E8 啟動子的DNA序列，其基因序列如SEQ ID NO: 6所不。
[0014] 在獲得上述兩段基因片段之后，采用辦〇 7-分e 7?酶切后去掉GFP片段并用上 述兩段基因片段替換掉常用植物表達(dá)載體PX6-GFP中的GFP基因，最終即可獲得植物表達(dá) 載體 pX6_E8:
[0015] 最終獲得的植物表達(dá)載體pX6-E8-2: : 導(dǎo)入農(nóng)桿菌工程菌株AGL1。通過 葉盤法轉(zhuǎn)化番茄品種CSL，獲得PCR轉(zhuǎn)基因植株，通過PX6載體引物PX6F1，其基因序列 如SEQ ID N0:7所示，和PX6F2,其基因序列如SEQ ID N0:8所示，擴(kuò)增轉(zhuǎn)入載體的E8-2及 也7整體序列，驗證轉(zhuǎn)基因陽性植株。利用HPLC對轉(zhuǎn)基因陽性株系的番茄果實進(jìn)行 了類黃酮和咖啡?？崴岷繖z測，轉(zhuǎn)基因材料的果實果皮中以上物質(zhì)的含量都有明顯的 提高，通過ABTS +方法測量番茄果實的抗氧化能力相比野生型有明顯的提高。
[0016] 在上述技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)已經(jīng)克隆的也基因作探針，從cDNA和基因組文 庫中篩選可得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，米用PCR(polymerase chain reaction) 技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的也基因以及任何感興趣 的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含也基因的序 列包括基因片段的基本上相當(dāng)于SEQ ID NO :1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO :1所示序列的亞片段，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因 植物。
[0017] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人首次提供了一種通過賦予茄科植物積累類黃酮包括蘆 丁、山奈酚蕓香苷等，以及咖啡酰奎尼酸能力進(jìn)而大幅度提高茄科植物抗氧化能力的DNA 片段，該片段從擬南芥中獲得，包含提高番茄果實抗氧化能力基因也發(fā)明人提供了 該片段的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用的具體方法；本發(fā)明利用番茄果實特異性表達(dá)啟動子 E8-2,驅(qū)動在番茄果實中特異表達(dá)，大大提高了番茄果實中類黃酮和咖啡?？?酸含量，其中，類黃酮包括蘆丁提高18. 2倍、山奈酚蕓香苷提高33. 1倍，以及一咖啡?？?酸提高18. 1倍、二咖啡酰奎尼酸提高68. O倍、三咖啡酰奎尼酸提高108. 4倍，并將番茄果 實抗氧化能力提高3倍以上；從而驗證了擬南芥基因具有提高番茄果實抗氧化能 力的功能；同時建立在此基礎(chǔ)上，以栽培型小果番茄作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)類黃酮和咖啡酰 奎尼酸生物制品，實行產(chǎn)業(yè)化；也可以此獲得番茄的工程細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)類黃 酮和咖啡酰奎尼酸。同時本發(fā)明番茄中使用的轉(zhuǎn)化載體可以通過雌二醇的誘導(dǎo)作用剔除篩 選標(biāo)記，得到具有食用安全性的抗氧化番茄品種，進(jìn)行品種培育。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的全過程流程圖； 圖2a為E8-2啟動子PCR擴(kuò)增后電泳圖； 圖 2a 中 M 為 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 為 E8-2 啟動子； 圖2b為也基因 PCR擴(kuò)增后電泳圖； 圖 2b 中 M 為 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 為也基因； 圖3為E8-2啟動子TA克隆經(jīng)及^7? J酶切后電泳圖； 圖中M為Trans2K DNA Marker，1為E8-2啟動子陽性克?。?圖4為過渡載體pX6-E8-2經(jīng)通〇 J-分e I酶切后電泳圖， 圖中M為rans2K DNA 1&^1?51'，2為口乂648-2陰性克隆，3、4和5為構(gòu)建口乂648-2陽性 克??； 圖5為pX6- E8-2::也重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖， 圖中 M 為 TaKaRa DNA Marker DL 2, 000,1 為 pX6- E8-2::也陽性克隆 圖6為番茄遺傳轉(zhuǎn)化不同時期的示意圖； 圖中A為愈傷組織誘導(dǎo)后示意圖；B為分化產(chǎn)生不定芽時示意圖；C為再生苗生根示意 圖；D為轉(zhuǎn)基因苗移栽大田后植株不意圖；E為Ttl代轉(zhuǎn)基因果實不意圖； 圖7為轉(zhuǎn)基因植株中目的基因也的PCR檢測結(jié)果示意圖， 圖中M為TaKaRa DNA Marker DL 2, 000，P1為陽性對照，P9為陰性對照，2-8為轉(zhuǎn)基因 植株； 圖8為野生型（CSL)和轉(zhuǎn)基因果實果皮（CSLll-I)提取液HPLC分析結(jié)果示意圖， 圖9為轉(zhuǎn)基因番茄果實（CSL)和轉(zhuǎn)基因果實果肉（CSLll-I)提取液HPLC分析結(jié)果示 意圖， 圖中Sl為綠原酸；S2為蘆??；S3為1，5-二咖啡?？崴?；S4為山奈酚蕓香苷；S5為 3,4, 5-三咖啡?？崴?； 圖10為野生型（CSL)和三個不同轉(zhuǎn)基因1\代株系果實果皮及果肉（CSL11-1，CSL2-1， CSL13-1)提取液抗氧化能力分析結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0019] 以下實施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明 作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本 領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)； 本發(fā)明中所涉及的多種培養(yǎng)基具體如下： MS 培養(yǎng)基：100 mL 10XMSmax，10 mL 100XMSmin，10 mL 100XFe2-EDTA，1