0 mL IOOXTomato Vitamin, 30 g鹿糖，氫氧化鉀或鹽酸調(diào)pH至5.7-5. 8,定容至I L。若為MS 固體培養(yǎng)基，加入0. 8%瓊脂粉。
[0020] 番茄預(yù)、共、后培養(yǎng)基：在上述MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加生長(zhǎng)素(吲哚三乙酸）和玉米 素，終濃度分別為〇· 2 mg/L和2 mg/L。
[0021] 番茄分化培養(yǎng)基：在上述MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，使用前添加羧芐青霉素和卡那霉素， 終濃度分別為400 mg/L和30 mg/L。
[0022] 番茄生根培養(yǎng)基：在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，添加生長(zhǎng)素和羧芐青霉素，終濃度分別為 0· I mg/L和 400 mg/L。
[0023] 實(shí)施例1 1.番茄果實(shí)特異性E8-2啟動(dòng)子和基因 DNA的克隆 以番茄品種中蔬4號(hào)基因組DNA為模版，引物E8PF1，其基因序列如SEQ ID NO :4所示， 和E8PR1，其基因序列如如SEQ ID NO :5所示，組合擴(kuò)增，得到預(yù)期I. I kb片段（圖2 a所 示)。進(jìn)而將E8PF1/R1組合擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，連接到PCR產(chǎn)物克隆載體pGEM-T Easy 載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得大量克隆。利用特異性引物組合E8PF1/R1對(duì)隨機(jī)挑選的 12個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，得到8個(gè)有目標(biāo)片段插入的克隆。隨機(jī)挑選兩個(gè)克隆提取質(zhì) 粒并使用EcoR I酶切驗(yàn)證，確認(rèn)其攜帶目標(biāo)片段（圖3所示)，該片段經(jīng)測(cè)序其序列為SEQ ID NO :6。
[0024] 根據(jù)PCR方法，以擬南芥Col-I來源的DNA為模板，通過特異引物也F1，其 序列如SEQ ID NO :2所示，和也Rl，其序列如SEQ ID NO :3所示，高保真擴(kuò)增全長(zhǎng) 也基因，約1.8 kb (圖2 b所示）。測(cè)序結(jié)果顯示其序列如SEQ ID NO :1。
[0025] pX6載體選用現(xiàn)有的PX6-GFP，通過常規(guī)的Xho I-Spe I雙酶切后去掉GFP片段后 備用，以與上述E8-2啟動(dòng)子克隆以及也基因連接構(gòu)建pX6-E8-2::也載體。
[0026] 試驗(yàn)中用到的引物序列及說明見表1所示。
[0027] 表1引物說明表
2.植物表達(dá)載體pX6-E8-2::J/?ii(〇rZ 7的構(gòu)建 將克隆到TA克隆的E8-2啟動(dòng)子片段，經(jīng)通〇 J-分e 7?酶切后電泳回收，并與相同酶 切回收的PX6-GFP載體連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后隨機(jī)挑取重組子，經(jīng)通〇 J-分e 7?酶切后 電泳檢測(cè)，重組子酶切結(jié)果中含有目標(biāo)片段，大小約I. I kb，表明過渡載體pX6-E8-2構(gòu)建 成功(如圖4)。該過渡載體進(jìn)一步用E8啟動(dòng)子特異引物E8PF1/R1進(jìn)行PCR驗(yàn)證，再次證實(shí) 過渡載體PX6-E8-2構(gòu)建成功。
[0028] PX6-E8-2過渡載體經(jīng)分e J酶切后，去磷酸化處理，同時(shí)膠回收的片 段。連接轉(zhuǎn)化后采用菌落PCR篩選到1個(gè)攜帶有目標(biāo)基因片段且通過測(cè)序驗(yàn)證插入方向正 確的克隆(如圖5)。該重組載體經(jīng)測(cè)序重復(fù)驗(yàn)證后導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101并進(jìn)行番茄遺傳 轉(zhuǎn)化。
[0029] 實(shí)施例2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) 1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化 利用番茄子葉為外植體，采用農(nóng)桿菌（GV3101菌株）介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將植物表達(dá)載 體PX6-E8-2: : 轉(zhuǎn)化CSL受體材料。一切操作均在嚴(yán)格的無菌環(huán)境下進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因 操作基本程序如下： 1)種子經(jīng)75%乙醇消毒I min，有效氯2% NaOCl處理15 min，無菌蒸餾水洗滌4-5次， 播種于1/2MS培養(yǎng)基，間距適宜，24-26°C暗培養(yǎng)3-4 d后轉(zhuǎn)移到16 h光照/8 h黑暗下培 養(yǎng)至子葉完全展開。
[0030] 2)刀片切除子葉前后兩段，留取中間約0. 5 cm葉片，近軸面朝上置于預(yù)培養(yǎng)基， 24-26°C暗培養(yǎng)2 d。外植體預(yù)培養(yǎng)的同時(shí)，采用平板劃線法，28°C大規(guī)模培養(yǎng)含有重組表達(dá) 載體的農(nóng)桿菌菌株。
[0031] 3) MS培養(yǎng)液重懸農(nóng)桿菌，濃度0D600=0. 4-0. 6浸泡侵染25-30 min。無菌濾紙吸 干菌液，近軸面朝上24-26°C黑暗條件共培養(yǎng)2 d。
[0032] 4)無菌蒸饋水洗漆外植體4-5次，每次30 min，最后用濃度為250 ppm羧節(jié)青霉 素水洗30 min，無菌濾紙吸干，近軸面朝上24-26°C 16 h光照/8 h黑暗條件后培養(yǎng)3 d。
[0033] 5)外植體轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，每2周繼代一次至抗性芽分化。
[0034] 6)當(dāng)抗性芽長(zhǎng)到2-3 cm時(shí)，切下并插入生根培養(yǎng)基。當(dāng)有大量根長(zhǎng)出時(shí)，洗凈根 部培養(yǎng)基并移栽到溫室。
[0035] CSL作為受體材料獲得15株獨(dú)立的TO代轉(zhuǎn)基因植株（圖6)。再生苗生根后移栽 溫室，加強(qiáng)對(duì)飛虱、蚜蟲、紅蜘蛛、潛葉蠅等番茄常見蟲害的管理和防治，掛果時(shí)期適當(dāng)追施 肥料。
[0036] 2.轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) 選取幼嫩番茄葉片，利用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，以包含 也iiozZ 7基因全長(zhǎng)DNA在內(nèi)的外側(cè)載體引物PX6F1/R1進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊 脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出與PX6-E8-2: : 質(zhì)粒擴(kuò)增同樣大小約3 kp片段（圖7) 為陽(yáng)性植株，陽(yáng)性植株有10株，陽(yáng)性率為：67%。
[0037] 實(shí)施例3番茄果實(shí)類黃酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析 轉(zhuǎn)基因番茄在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期與非轉(zhuǎn)基因植株并無明顯差異，從變色期開始，轉(zhuǎn)基因果 實(shí)的果皮逐漸趨向桔紅色或深黃色，對(duì)照果實(shí)仍然維持相應(yīng)的紅色，后續(xù)HPLC分析證明了 轉(zhuǎn)基因果實(shí)的顏色變化與蘆丁等類黃酮物質(zhì)和咖啡?？崴岷康脑黾樱▓D8、圖9)存在 一定聯(lián)系。番茄果實(shí)類黃酮和咖啡酰奎尼酸含量HPLC分析方法如下：待通過上述步驟獲得 的番茄成熟收獲后，用冷凍干燥機(jī)（EYELA FDU-1100，Τ0Κ0Υ0 RIKAKIAI CO. LTD)冷凍干燥 后研成粉末。以每mg凍干粉末溶于30μ1 70%甲醇的比例溶解后，置于-20°C 3h進(jìn)行類 黃酮提取，提取液經(jīng)1600g離心后使用0. 45 μ m濾膜過濾上清液，取20 μ 1過濾液用于HPLC 分析，按照Luo等（2009)設(shè)置HPLC條件，標(biāo)準(zhǔn)品為蘆丁、綠原酸和山奈酚蕓香苷(分別購(gòu)自 Sigma和Extrasynthese公司），1，5-二咖啡?？崴岷?, 4, 5-三咖啡酰奎尼酸購(gòu)于成都 普瑞法科技開發(fā)有限公司。
[0038] 利用HPLC對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了類黃酮和咖啡酰奎尼酸含量檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因材 料均有明顯提1?。
[0039] 轉(zhuǎn)基因果實(shí)果皮綠原酸含量最高達(dá)到304. 44 Pg/g DW，與對(duì)照相比提高了 18. 1 倍；二咖啡?？崴峒叭Х弱？崴岱謩e與對(duì)照相比提高了 68. 0和108. 4倍；另外，蘆 丁和山奈酚蕓香苷的含量也分別提高了 18. 2倍和33. 1倍，如表2所示。
[0040] 表2 CSL轉(zhuǎn)基因番茄TO代類黃酮和咖啡酰奎尼酸含量統(tǒng)計(jì)
在10株轉(zhuǎn)基因株系中選取了 3株（CSL-2, CSL-11，CSL-13)利用HPLC進(jìn)行T1代陽(yáng)性 轉(zhuǎn)基因株系中類黃酮和咖啡?？崴岷繖z測(cè)，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性材料含量與Ttl代相比均穩(wěn)定遺 傳，具體見表3所示。
[0041] 表3. CSL轉(zhuǎn)基因番茄T1代類黃酮和咖啡?？崴岷拷y(tǒng)計(jì)
實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)抗氧化能力分析 上述HPLC分析證明了轉(zhuǎn)基因果實(shí)中類黃酮物質(zhì)和咖啡?？崴岷康脑黾樱▓D8、圖 9,表2,表3)。番茄果實(shí)抗氧化分析方法如下：待通過上述步驟獲得的番茄成熟收獲后，用 冷凍干燥機(jī)（EYELA FDU-1100，TOKOYO RIKAKIAI CO. LTD)冷凍干燥后研成粉末。以每50mg 凍干粉末溶于70%甲醇的溶解后，用測(cè)定抗氧化活性的ABTS+法對(duì)轉(zhuǎn)基因及野生型番茄果 實(shí)果皮和果肉分別進(jìn)行抗氧化分析能力測(cè)定。在酶標(biāo)板上以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，能過酶標(biāo) 儀（SYNERGY MX全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，ΒΙ0ΤΕΚ)測(cè)定抗氧化物質(zhì)對(duì)預(yù)先制備的自由基ABTS+ 的清除能力，將待測(cè)物質(zhì)的清除自由基能力與Trolox清除自由基的能力相對(duì)比，確定相對(duì) 抗氧化活性，單位為抗氧化量TEAC，即可反應(yīng)出果實(shí)中提取抗氧化活性物質(zhì)的效率。
[0042] 利用ABTS+方法測(cè)定T i代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因果實(shí)果皮及果肉抗氧化能力，轉(zhuǎn)基因材料果 皮抗氧化能力時(shí)顯增強(qiáng)，其中CSLl 1-1陽(yáng)性株系抗氧化能力上升了 3倍左右，其他兩個(gè)轉(zhuǎn)基 因株系提高倍數(shù)在2-2. 5倍（圖10)。這與HPLC測(cè)定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系中蘆丁的含量差異有 很明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系(表3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提1?番爺抗氧化能力的基因，其核昔酸序列如SEQIDNO:1所不。2. -種權(quán)利要求1所述基因的番茄果實(shí)特異性啟動(dòng)子E8-2,其核苷酸序列如SEQID NO:6所示。3. -種含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的番爺果實(shí)表達(dá)載體 pX6_E8_2:4. 權(quán)利要求1所述的一種提高番茄抗氧化能力的基因在提高番茄中類黃酮和多種咖 啡?？崴岷恐械膽?yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的一種提1?番爺抗氧化能力的基因在提1?番爺抗氧化能力中的應(yīng) 用。6. 權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體pX6-E8-2: : 在提高番爺抗氧化能力中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高番茄抗氧化能力的基因AntioxL1，該基因片段從擬南芥中獲得，發(fā)明人提供了該片段的分離、克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用的具體方法，利用番茄果實(shí)特異性表達(dá)啟動(dòng)子E8-2，驅(qū)動(dòng)該基因在番茄果實(shí)中特異表達(dá)，大大提高了番茄植物中類黃酮和咖啡?？崴岷?，其中，類黃酮包括蘆丁提高18.2倍、山奈酚蕓香苷提高33.1倍，以及一咖啡?？崴崽岣?8.1倍、二咖啡酰奎尼酸提高68.0倍、三咖啡?？崴崽岣?08.4倍，并將番茄果實(shí)抗氧化能力提高3倍以上。
【IPC分類】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/84, C12N15/29
【公開號(hào)】CN104894140
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510173048
【發(fā)明人】丁新華, 儲(chǔ)昭輝, 李洋
【申請(qǐng)人】安徽拜森生物科技有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年4月14日