豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片以及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片以及 檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)?；较虬l(fā)展，規(guī)?；i場(chǎng)疫病多發(fā)、多種病原混 合感染較普遍存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定損失。其中豬偽狂犬病毒（PRV)、豬圓環(huán)病毒2型 (PCV2)是引起豬繁殖障礙的兩種重要疫病病原。這兩種病臨診癥狀相似，需要進(jìn)行鑒別診 斷。
[0003] 目前，對(duì)這兩種疾病的診斷多采用分離鑒定及常規(guī)的血清學(xué)方法，所需時(shí)間較長(zhǎng)， 也有PCR技術(shù)的鑒別方法，但還沒有建立操作性強(qiáng)且能同時(shí)鑒別兩種病毒的方法。因此，有 必要建立能同時(shí)進(jìn)行兩種疫病快速檢測(cè)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、可同時(shí)檢測(cè)豬偽狂犬 病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的可視化基因芯片和試劑盒。
[0005] 基因芯片，是指指通過(guò)不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多肽、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0006] 本發(fā)明檢測(cè)豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的基因芯片，它包括固相載體以 及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :1和/或3所示基因片段，用于分別 檢測(cè)偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型。
[0007] 優(yōu)選地，它還包括SEQ ID NO :2所示所示探針，用于檢測(cè)偽狂犬病毒野毒株。
[0008] 其中，它還包括質(zhì)控探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4和/或SEQ ID NO :5所 不O
[0009] 本發(fā)明檢測(cè)豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型的試劑盒，它包括前述的基因芯 片以及擴(kuò)增試劑；其中，擴(kuò)增試劑包括SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :10~11所示引物對(duì)， 用于擴(kuò)增偽狂犬病毒野毒株的基因。
[0010] 優(yōu)選地，它還包括SEQ ID NO :8~9所示引物對(duì)，用于擴(kuò)增偽狂犬病毒野毒株的基 因。
[0011] 優(yōu)選地，所述SEQ ID NO :6、8、10所示上游引物標(biāo)記有生物素。
[0012] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :1、3所示基因片段在制備檢測(cè)豬偽狂犬病毒和/或豬 圓環(huán)病毒2型的基因芯片的用途。
[0013] 優(yōu)選地，所述基因芯片還包括SEQ ID NO :2所示所示探針，用于檢測(cè)偽狂犬病毒野 毒株。
[0014] 本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :6~7、SEQ ID NO :10~11所示引物對(duì)以及SEQ ID NO :1、3所示基因片段在制備檢測(cè)豬偽狂犬病毒和/或豬圓環(huán)病毒2型中的用途；其中，兩 對(duì)引物對(duì)為擴(kuò)增試劑，SEQ ID NO :1或3所示基因片段為檢測(cè)探針。
[0015] 優(yōu)選地，所述基因芯片還包括SEQ ID NO :2所示所示探針以及SEQ ID NO :8~9 所示引物對(duì)，用于檢測(cè)和擴(kuò)增偽狂犬病毒野毒株的基因。
[0016] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以有效檢測(cè)豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型，還能區(qū) 分豬偽狂犬病毒的疫苗株與野毒株感染，具有特異性好、靈敏性高和保存期長(zhǎng)等特點(diǎn)，耗時(shí) 短，檢測(cè)快速，檢測(cè)結(jié)果的觀察直觀，無(wú)需昂貴的設(shè)備，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情況， 臨床應(yīng)用前景良好。
[0017] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1 :陣列排布示意圖
[0019] 圖2:點(diǎn)陣設(shè)置圖示
[0020] 圖3 :樣品設(shè)置圖示
[0021] 圖4 :芯片預(yù)雜交的組裝圖示
[0022] 圖5 :芯片特異性檢測(cè)結(jié)果A:PRV檢測(cè)結(jié)果；B:PPV檢測(cè)結(jié)果；C:PCV2檢測(cè)結(jié)果； D:PRV+PPV檢測(cè)結(jié)果；E:PRV+PPV檢測(cè)結(jié)果；F:PRV+PCV2檢測(cè)結(jié)果
[0023] 圖6 :gB探針基因不同稀釋度芯片靈敏性檢測(cè)結(jié)果
[0024] 圖7 :gE探針基因芯片靈敏性檢測(cè)結(jié)果
[0025] 圖8 :0RF2探針基因芯片靈敏性檢測(cè)結(jié)果
[0026] 圖9 :穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)方法
[0028] 一、探針基因的設(shè)計(jì)以及包含探針的質(zhì)粒菌的構(gòu)建
[0029] 1 材料
[0030] I. 1 種毒
[0031] PRV Fa株，由衛(wèi)生部成都生物制品研宄所惠贈(zèng)；
[0032] PCV2由本實(shí)驗(yàn)室趙春容從四川資陽(yáng)病料中分離；
[0033] 豬細(xì)小病毒滅活疫苗購(gòu)自北京中海科技動(dòng)物保健科技公司。
[0034] 1. 2探針基因重組質(zhì)粒菌
[0035] T/GAPDH由英駿生物公司合成。
[0036] L 3主要實(shí)驗(yàn)儀器
[0037] 電子天平：Sartorius BP 310S ;
[0038] 超純水儀：Milli Qplus，法國(guó)產(chǎn)；
[0039] 超凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；
[0040] 恒溫?fù)u床：真空機(jī)：SinBo,香港；
[0041] 恒溫水浴鍋；Thermo Savant冷凍干燥儀；
[0042] 核酸蛋白檢測(cè)儀：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010 ;
[0043] 高速冷凍離心機(jī)3K18型：SigmaR，德國(guó)產(chǎn)；
[0044] Mini-SUB凝膠電泳裝置，電泳儀：POWER Pac300,凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)2000型： Bk)-R/\DB，意大利產(chǎn)；
[0045] 梯度 PCR 儀：PX 2, Thermo hybaid ;分子雜交儀：Thermo,美國(guó)產(chǎn)；
[0046] 晶芯? SmartArrayer?48 (微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)），晶芯? LuxScan?10K微陣列芯片 掃描儀：Capitalbio Corporation，北京博奧生物有限公司；
[0047] 高純氮?dú)馄浚核拇ü诜鍤怏w有限公司生產(chǎn)。
[0048] 1. 4主要試劑
[0049] Plasmid miniprep Kit，Gel Extractraction Kit，均購(gòu)自 Omega (美國(guó)）生物技 術(shù)有限公司；
[0050] 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、50bp DNA LadderUOObp DNA Ladder、 2XTaq PCR MasterMix、DH5a感受態(tài)細(xì)胞-化學(xué)轉(zhuǎn)化，Amp均購(gòu)自北京天根生化科技有限公 司；
[0051] PUC18Cloning Vector，pMD19-T Simple克隆試劑盒，均購(gòu)自寶生物（大連）科技 有限公司；
[0052] LB 液體培養(yǎng)基（含 100mg/ml Amp) ;LB 平板（含 100mg/ml Amp)等。
[0053] Western Blot膜封閉液，購(gòu)自天根生物科技有限生司；
[0054] Streptavidin-HRP，DAB Kit (Brown)購(gòu)自英駿生物科技有限公司；
[0055] Baio?點(diǎn)樣緩沖液，購(gòu)自上海百傲生物工程有限公司；
[0056] 預(yù)雜交緩沖液：甲酰胺 50ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd' s 5ml、脫脂奶粉 5g、 0· 2M Na3PO4IOml,超純水定容至 100ml ;
[0057] 雜交緩沖液，甲酰胺45ml、20XSSC 25ml、100Xdenhartd's 1ml、脫脂奶粉2g、20m M Na3PO4 (pH 6· 5) 10ml，超純水定容至 100ml ;
[0058] 尼龍膜，購(gòu)自GE Healthcare ;硝酸纖維素膜，購(gòu)自Millipore.
[0059] 0· 2M PBS 緩沖液：NaCl 8g、KCl 0· 2g、Na2HPO4L 42g、KH2PO4O. 27g，定容至 IL ;
[0060] 洗液 I :1XSSC 0· 1% SDS ;洗液 II :0· 2XSSC 0· 1% SDS ;洗液III :0· 2XSSC ;超 純水。
[0061] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0062] 2. 1探針設(shè)計(jì)
[0063] 2. I. IPRV
[0064] PRV-gB 基因 （SEQ ID NO :1):
[0065] TCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAACGTCGCCCCGCACAAGTTCAAGGCCCACATCTACTACAAGAACGT CATCGTCACGACCGTGTGGTCCGGGAGCACGTACGCGGCCATCACGAACCGCTTCACGGACCGCGTGCCCGCCCC CGTGCAGGAGATCACGGACGTGATCGACC