專利名稱：豬鏈球菌快速檢測試劑盒的制備和使用方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域中的檢測方法，具術步及一種豬鏈球菌快速檢測試 齊U盒的制備和4頓方法。
技術背景豬鏈球菌(streptococcus suis)是一種廣泛分布于哺乳動物和人體內的溶血性鏈 球菌。卵圓形，大小為O. 7—1. 4微米，往往成兩個以上的菌體相連接成鏈狀。革蘭氏 染色陽生。該菌抵抗力不強，對TH、濕熱均較敏感，常用消毒藥可將其殺死。在動物 機f射氏抗力降低和外部環(huán)境變化誘導下，該菌會引發(fā)豬鏈球菌病，屬國家規(guī)定的二類動 物疫病，是一種人畜共患傳染病。表現(xiàn)為急性出血'卿夂血癥、心內膜炎、腦膜炎、關節(jié) 炎、哺乳仔豬下痢和孕豬流產等。^^連球菌感染不僅可致豬敗血癥肺炎、腦膜炎、關節(jié) 炎及心內膜炎，而且可感^f寺定人群發(fā)病，并可致死亡，危害嚴重。本病一年四季均可 發(fā)生，以冬春季多發(fā)，不同年齡均可發(fā)病，病豬和病愈帶菌豬是本病的主^(專染源，病 原存在于各臟器、血液、肌肉、關節(jié)和排泄物中，主要經消化道禾噸傷的皮膚感染，根 據感染發(fā)病的種類不同，發(fā)病率及死亡率均有不同。同時病源性豬鏈球菌也可以感m 類，引發(fā)魚類疾病。病魚眼球明顯突出，其周圍充血，鰓蓋內偵l琉血發(fā)紅鄉(xiāng)lj烈出血， 在夏季高水溫時這，狀發(fā)展ffijl。以往檢測豬鏈球菌的主要方法有三種1.生理生化鑒定技術，該法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；2.酶聯(lián)免疫吸附it驗，3.聚合酉敏連式反應法(PCR法)， 該方法較前兩種方法決速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。目前尚未見用環(huán)介導等顯擴增 方法檢測辯連球菌的試劑敘方法。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是掛共一種快速、特異性強、靈敏度高而且成本低的、用環(huán)介導等溫 擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反應的方法檢測豬鏈球菌的試劑盒-一擗連球菌快速檢測試劑盒的制備和4頓方法，從而為食品安全掛共科學的依據 和指導作用。本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個內引 物(上游內引物和下游內弓嫩)和兩個外引物(上游外引物和下游夕卜弓嫩)，內引物包含 耙DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內弓胸首先禾瞎巴DNA雜交，隨后的,體換DNA 合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外弓l物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到耙的另一端的一個內弓胸和一個外弓l物啟動的DNA合淑莫板，產生一個 原始的莖環(huán)DNA; (3)內弓嫩以原始莖環(huán)DNA做豐對反，啟動f體換DNA的合成，產生一 個原始的莖環(huán)DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環(huán)DNA; (4)在^^^f牛下，內引物以 莖環(huán)DNA為申對反，Sii鏈置換形成多M有耙DNA反復重餅列的莖環(huán)DNA，在一小時 內該循環(huán)反應可使耙DNA累積到IO 9拷貝，可通過熒光染料5^見察擴增結果。本發(fā)明涉及的一種l^連球菌決速檢測試劑盒其中的試齊抱括以下(1) - (4): (1)環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A 、 (2) UNG酶、(3) Bst DNA聚合酶B和 (4)顯色劑C 。其中，(1)環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A :包括lOXThermopol反應緩沖液、300—500 umol /L dNTP、 2—4mmol/L硫酸鎂 (MgS04)、 0.8—1.2"mol/L上游引內物(FIP)、 0. 8—1. 2 y mol/L下有內引物(BIP)、 0. 2—0. 3 u mol/L上游外弓|物(F3)、 0. 2—0. 3 umol/L下游內引物(B3)和l一l. 5mol /L 甜熟咸；其中戶斤述的上游內引物5_ TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC -3、 下游內弓l物5-ACGTTGGTMGGMACCMGGATGATTTCAACMCAGCTTCT -3、 上游外引物5- CGTGCGCTTMATTCTATGC-3、 下游外弓l物5- GAGMATTCCTTCACCGTAC---3其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dl)TP: dATP: dGTP: dCTP=2:1:1:1。 其中所述的lOXThermopol反應緩沖液中含有200mmol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基 甲烷一鹽酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化鉀(KC1)、 100咖ol/L硫f斂安((NH4) 2S04)、 20mmol/L硫酉數美(MgSCO禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶llJ/yL;(3) Bst DNA聚合酶B: 8U/mL;(4) 顯色劑C:為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面戶脫環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A每管23uL的最佳組成為2.5uL 10XThermopol反應緩沖液、1. 0 y L 10mraol/L dNTP、 1. 0 u L 20 u mol/L上游內引物(FIP)、 1.0tiL20umol/L下訪,內弓14勿(BIP)、 0. 25 u L 20 u mol/L —t訪字夕卜弓l華勿(F3)、 0. 25yL20 n mol/L下游外弓|物(B3)、 0. 5 " L 100咖ol/LMgS04、 12. 5 u L 2mol/L甜^5顱n 4y L ddHzO (滅菌雙蒸水)。使用上述試劑^測豬鏈球菌的檢測方法，依次包括下列步驟(1)樣品(待檢樣品或者培養(yǎng)菌液)DNA的提取步驟A.取200 mg待檢樣品或者1.0—1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5—10min，棄上清液；B. 加入1. O—l. 5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5 —編n，棄上清液；C. 加入100—150PL滅菌雙蒸水，混勻，10(TC沸7jC浴中加熱10—15min;D. 用臺式離心機10000-12000轉/分離心5—10min,取上清至另外一個1. 5mL離 心管中，即為待檢模板DNA;(2)進行豬鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增反應步驟A. 在裝有23 y L LAMP反應液A的反應管中加入1 ti L待檢豐對反DNA，禾口 0. 5 y L的 UNG酶，再于叵匿屬浴上95。C放置3—5min，立即置于冰上l一3min;B. 在上述的反應管中加入luL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒^^屬浴上60—65。C放置45—90min;D. 將金屬浴調到80—95。C中止反應，3—5min后取出待檢待檢； (3)顯色檢測在待檢的齡反應管中加入1 " L顯色劑C，直接用肉鵬見察顏色變化，如果顏色 為黃色，說明待檢細菌不是辯連球菌，如果顏色變?yōu)榫G色，貝頓明樣品為辦連球菌。本發(fā)明泉立了^f連球菌快速檢觀賦劑盒的制備和^頓方法，本試劑盒根據^l連球菌 的glnA基因的基本保守區(qū)的六個序歹股計了兩啊寺異性內引物和兩1^寺異性外弓嫩， 該保守基因序列為辯連球菌各不同血清型和菌株型所共有，以保證從種的水平上檢測不 同來源的雜連球菌株的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導等尉廣增(LAMP)技術，該技術特異 性強，與PCR檢測方法有相同的高靈每娘，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴 或7X浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方纟珠觀察，4頓熒光染料來觀察即可，簡單而 快速?？捎糜谵q連球菌的檢測，特別適用于基層醫(yī)療機構以及#51場現(xiàn)場應用。下列實例進一步說明本發(fā)明，但不應當作對本發(fā)明的限制。 實施例1按下列配方制作豬鏈球菌決速檢測試劑盒包括如下(1) - (4):(1) LAMP反應液A:包括2. 5 ti L 10 X Thermopol反應緩沖液、1. 0 u L 10鵬1/L dNTP、 1. 0 u L 20 " mol/L 上游內引物(F工P)、 l.OuL 20pmol/L下游內引物(BIP)、 0.25uL 20umol/L上游外 弓l物(F3)、0. 25 " 20 ix mol/L下游夕卜弓1物(B3)、0. 5 y L 100翻1/L MgSO.,、 12. 5 u L 2mol/L 甜熟鵬4"L dd恥(滅菌雙蒸水)。其中所述的上游內引物5_ TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC -3;下游內引物5-ACGTTGGTMGGAAACCMGGATGATTTCMCMCAGCTTCT -3; 上游外引物5- CGTGCGCTTAAATTCTATGC -3; 下游外引物5- GAGAMTTCCTTCACCGTAC -3。其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP二2:l:l:l。 其中所述的lOXThermopol反應緩沖液中含有200咖ol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基 甲垸一鹽酸(Tris—HC1)、 100咖ol/L氯化鉀(KC1)、 100咖ol/L硫酸4安((肌)2S04)、 20mmol/L硫酉數美(MgS0J禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1U/卩L;(3) Bst DNA聚合酶B:請iaL;(4) 顯色劑C:為10 %的熒光染料SYBR GREEN工。按照以下辦進行檢測(1) 樣品或者細菌DNA的提取A. 取200 mg待檢樣品或者1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式 離心機10000轉/分離心10min，棄上清液；B. 加入1.0—1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000轉/分離心10min， 棄上清液；C. 加入150uL滅菌雙蒸水，混勻，100。C沸水浴中加熱一15min;D. 用臺式離心機10000轉/分離心5min，取上清液至另一個1. 5mL離心管中，即 為待檢模板DNA;(2) 進行豬鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增反應A. 在裝有23 ii L LAMP反應液A的反應管中加入1 u L待檢模板DNA，和0. 5 tx L的 UNG酶，再亍瞎jg^屬浴上95。C放置5min，立即置于冰上lmin;B. 在上述反應管中加入luL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒^l^屬浴上65。C放置1小時；D. 將金屬浴調到80。C中止反應，3min后取出待檢；(3) 顯色檢測在上述反應管中加入luL顯色劑C，直接用肉船見察顏色變化，如果顏色為黃色， 說明待檢樣品不含或者不是織連球菌，如果顏色變?yōu)榫G色，貝l脫明樣品含有或者是豬鏈 球菌。實施例2按下列配方制作^tf連球菌快速檢測試劑盒，包括如下(1) _ (4):(1) LAMP反應液A:包括2. 5 u L 10 XThermopol反應緩沖液、1. 0 " L 10mmol/L dNTP、 1. 0L 20 u mol/L 上游內引物(FIP)、 L0"L 20timol/L下游內引物(BIP)、 0.25uL 20umol/L上游外 弓l物(F3)、0. 25 u L 20 ti mol/L下游外弓l物(B3)、0. 5 u L 100mmol/L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L 甜熟卿"L ddH/)(滅菌雙蒸水)。其中戶腿的上游內弓嫩、下游內引物、上游夕卜弓嫩、下游外引物同上。 其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。 其中所述的10XThermopol反應緩沖液中含有200ramol/L pH8. 8的三羥基甲基氨基 甲烷一鹽酸(Tris—HCl)、 100腿ol/L氯化鉀(KC1)、 100咖ol/L硫酸銨((肌)2S04)、 20mmol/L硫酸1美(MgS0J和l^曲拉通X—l00 (Triton X—100);(2) 跳酶1U組；(3) Bst DNA聚合酶B: 8 U/mL;(4) 顯色劑C:為10X的熒光染料DNAGreen。按照以下禾，進行檢測(1) 樣品或者細菌DNA的提取A. 取200 mg待檢樣品或者1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式 離心機10000-12000轉/分離心5—10min，棄上清液；B. 加入1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機12000轉/分離心50min，棄上清液；C. 加入150uL滅菌雙蒸水，混勻，100。C沸水浴中加熱15min;D. 用臺式離心機12000轉/分離心5min，取上清液至另一個1. 5mL離心管中，即 為待檢模板DNA;(2) 進行豬鏈球菌的環(huán)介導，擴增反應A. 在裝有23 u L LAMP反應液A的反應管中加入1 y L待檢模板DNA，禾卩0. 5 u L的 UNG酶，再于恒^^屬浴上95。C放置5min，立即置于冰上lmin;B. 在，反應管中加入:UL Bst DNA聚合酶B;C. 于恒^^屬浴上6(TC方爐1小時；D. 將金屬浴調到9(TC中止反應，3min后取出待禾金；(3) 顯色檢測在上述反應管中加入1 y L顯色劑C，直接用剛歡見察顏色變化，如果顏色為黃色， 說明待檢樣品不含或者不是辯連球菌，如果顏色變?yōu)榫G色，貝IJ說明樣品含有或者是辯連 球菌。
權利要求
1.一種豬鏈球菌快速檢測試劑盒，其特征是其中的試劑包括(1)環(huán)介導等溫擴增反應液A包括10×Thermopol反應緩沖液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol/L上游內引物、0.8-1.2μmol/L下游內引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；其中所述的上游內引物5-TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCCATCTGTCCGTATGGATGTTC-3、下游內引物5-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGGATGATTTCAACAACAGCTTCT-3、上游外引物5-CGTGCGCTTAAATTCTATGC-3、下游外引物5-GAGAAATTCCTTCACCGTAC-3(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶B8U/μL；(4)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根據權利要求1中所述的豬鏈球菌快速檢測試劑盒，其特征是上述的 混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 根據權利要求1中所述的豬鏈球菌快速檢測試劑盒，其特征是上述的 環(huán)介導等溫擴增反應液A每管23 u L的組成為2. 5 ti L lOXThermopol反 應緩沖液、1.0uL 10mmol/L dNTP、 1.0" L 20ymol/L上游內引物、1.0 uL 20umol/L下游內引物、0. 25 u L 20 " mol/L上游外引物、0.25ixL20 umol/L下游外引物、0. 5"L lOOmmol /L MgS04、 12. 5 " L 2mol/L甜菜堿 禾口 4ti L ddH20。4. 一種豬鏈球菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征是依次包括下列步 驟(1) 待檢樣品DNA的提取A. 取200 mg待檢樣品或者1.0—1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1. 5mL 離心管中，用臺式離心機10000-12000轉/分離心5 — 10min，棄上清液；B. 加入1.0—1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000 轉/分離心5 — 10min，棄上清液；C. 加入100—150 iiL滅菌雙蒸水，混勻，100。C沸水浴中加熱IO — 15min;D. 然后用臺式離心機10000-12000轉/分離心5—10min，取其上清 液至另外 一 個1. 5mL離心管中，即為待檢樣品的模板DNA;(2) 進行豬鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增反應A. 在裝有23 ii L LAMP反應液A的反應管中加入1 u L待檢樣品模板DNA， 和O. 5uL的UNG酶，于恒溫金屬浴上5(TC放置3min，然后在95。C放置3 一5min，立即置于冰上1 一3min;B. 在上述反應管中加入1 u L Bst DNA聚合酶B;C. 于恒溫金屬浴上60 — 65。C放置45 — 90min;D. 將金屬浴調到80 — 95。C中止反應，3 — 5min后取出待檢；(3) 顯色檢測在待檢反應管中加入1"L顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果 顏色為黃色，說明待檢樣品或者細菌不含或者不是豬鏈球菌，如果顏色變 為綠色，則說明檢測出待檢樣品中含有或者為豬鏈球菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬鏈球菌快速檢測試劑盒的制備和使用方法。其中試劑盒內包括環(huán)介導等溫擴增反應液A、Bst DNA聚合酶B、顯色劑C；反應液A含有反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內引物5-TGATCTTTCTTGTCACCTGTTCC-ATCTGTCCGTATGGATGTTC-3、下游內引物5-ACGTTGGTAAGGAAACCAAGG-ATGATTTCAACAACAGCTTCT-3、上游外引物5-CGTGCGCTTAAATTCTATGC-3、下游外引物5-GAGAAATTCCTTCACCGTAC-3和甜菜堿；檢測豬鏈球菌的方法包括待測樣品或者細菌DNA的提取、豬鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增反應和顯色檢測。本發(fā)明優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高，而且成本低。
文檔編號C12Q1/68GK101260426SQ200710115178
公開日2008年9月10日 申請日期2007年12月13日 優(yōu)先權日2007年12月13日
發(fā)明者彪 徐, 朱來華, 梁成珠, 雷質文, 高宏偉 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心