專利名稱：快速檢測(cè)豬偽狂犬抗體的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)動(dòng)物疾病的試紙條，尤其涉及一種快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒 抗體的試紙條，本發(fā)明還涉及該試紙條的制備方法和應(yīng)用方法，屬于動(dòng)物疾病檢驗(yàn) 4t疫領(lǐng)i或。
背景技術(shù)：
豬偽狂犬病(Pseudorabies， PR)是由豬皰滲病毒I型引起的一種高度傳染性、 致死性傳染病。豬是該病最主要的貯存宿主和傳染源，健康豬與病豬、帶毒豬直接 接觸可感染本病。成年豬常為隱性感染；懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃 伊胎；新生仔豬出現(xiàn)發(fā)熱及神經(jīng)癥狀，甚至衰竭死亡，死亡率可達(dá)100%。近年來， 該病不斷傳播蔓延，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，公知的豬偽狂犬抗體快速檢測(cè)試劑盒(ELISA法)，系采用酶聯(lián)免疫技 術(shù)檢測(cè)樣品(血清)中豬偽狂犬抗體的方法。即釆用豬偽狂犬滅活弱毒或弱毒疫 苗抹經(jīng)純化、濃縮制成的抗原包被微孔板，在試驗(yàn)中，加入稀釋的對(duì)照血清和待檢 血清，經(jīng)溫育后，若樣品中含有豬偽狂犬特異性抗體，則將與微孔板上抗原結(jié)合， 經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后；再加入酶標(biāo)二抗，與微孔板上抗原抗體復(fù) 合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物，在孔中加TMB或OPD底 物液，與酶反應(yīng)形成有色產(chǎn)物，加入終止液反應(yīng)后，用酶標(biāo)4義固定波長(zhǎng)(450nm或 63Onm)測(cè)定各反應(yīng)孔中的OD值。ELISA適合大批樣品的檢測(cè)，成為了 一種常規(guī) 的檢測(cè)方法。但是，該方法抗原的制備過程必須經(jīng)過病毒的細(xì)胞培養(yǎng)、病毒純化等 繁瑣模式，特異性不高、穩(wěn)定性差，而且成本高；檢測(cè)時(shí)需要專門的儀器設(shè)備如酶 標(biāo)儀來配合使用，檢測(cè)操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；操作過程相對(duì)比較復(fù)雜；檢測(cè) 所需要時(shí)間比較長(zhǎng)；檢測(cè)所需費(fèi)用高。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種能夠快速檢 測(cè)豬偽狂犬病毒抗體的試紙條，該試紙條不需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，方法簡(jiǎn)便易學(xué)，不用任何儀器進(jìn)行輔助檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果特異性高，重復(fù)性好。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的 一種快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒抗體的試紙條，包括由樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜(NCM)、吸水墊和支持物組成；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬偽狂 犬gE蛋白包被而成的檢測(cè)線和由兔抗豬偽狂犬抗體包被而成的對(duì)照線；所述的玻璃 纖維膜結(jié)合由膠體金標(biāo)記的豬偽狂犬gE蛋白；玻璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊按 照以下次序相連接并附著在支持物上玻璃纖維膜與靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端 相連接，吸水墊與靠近硝酸纖維膜對(duì)照線的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維膜 上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相游f接。其中，所述的支持物只要具有一定的硬度，將樣品墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維 素膜和吸水墊負(fù)載于其上，達(dá)到支持和負(fù)載的目的即可，可以選用各種材料作為本 發(fā)明的支持物，例如塑料板(優(yōu)選為PVC)、硬紙板、鋁板等。所述的豬偽狂犬gE蛋白可按照常規(guī)的基因工程方法進(jìn)行制備或表達(dá)，這些方法 都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能掌握或通曉的。所述的兔抗豬偽狂犬抗體可參考以下方法制備得到用豬偽狂犬弱毒抗原釆用 多點(diǎn)注射法免疫陰性家兔3只，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后一次免疫IO 天后采血，分離血清，純化后得兔抗豬偽狂犬IgG。所述硝酸纖維素膜(該硝酸纖維素膜也可由尼龍膜來替換)上的4全測(cè)線和對(duì)照 線之間的間隔優(yōu)選為3-5mm,更優(yōu)選為4mm。一種制備本發(fā)明的檢測(cè)豬偽狂犬抗體的試紙條的方法，包括 (1 )用噴膜機(jī)將膠體金標(biāo)記的豬偽狂犬gE蛋白復(fù)合物噴涂在玻璃纖維膜上，備用；(2) 將豬偽狂犬gE蛋白和兔抗豬偽狂犬抗體IgG依次間隔3-5mm噴在硝酸纖 維膜上，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結(jié)合位點(diǎn)， 洗滌，干燥，備用；(3) 將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘在支持板 上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜 上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在硝酸纖 維素膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；(4)將粘好的支持板材料切成60mm長(zhǎng)、4mm寬的試紙條，即得。 本發(fā)明試紙條的檢測(cè)方法1操作方法在檢測(cè)前先將樣本和試紙條放在室溫條件下放置一段時(shí)間(10分鐘)，使其恢復(fù)至室溫；從鋁箔袋中取出檢測(cè)試紙條；在橢圓形加樣孔內(nèi)加入3—5 滴(100—200]itl )待檢豬血液或血清樣品；將試紙條平放在桌面上，在室溫下靜置 20分鐘判定結(jié)果； 2結(jié)果判斷無效在對(duì)照線和檢測(cè)線都不出現(xiàn)色線；陰性在對(duì)照線出現(xiàn)一條色線，在檢測(cè)線不出現(xiàn)色線；弱陽性在對(duì)照線出現(xiàn)一條顏色較深的紫紅色線，而在檢測(cè)線出現(xiàn)一條顏色很 淺的紫紅色線；陽性在對(duì)照線和檢測(cè)線各出現(xiàn)一條顏色較深的紫紅色線，樣品中的抗體表達(dá) 水平越高，檢測(cè)線色線顏色越深。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)表達(dá)豬偽狂犬gE蛋白，釆用酶聯(lián)免疫原理和膜層析技 術(shù)制成快速檢測(cè)豬血液或血清中抗體的試紙條。與ELISA和IFA相比，本發(fā)明具有以 下明顯的優(yōu)勢(shì)安全性好，無需培養(yǎng)病毒本身，避免了因操作病毒造成的病毒擴(kuò)散； 可以大批量制備，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉；抗原成分穩(wěn)定均一，操作簡(jiǎn)便省力， 不用儀器，檢測(cè)結(jié)果特異性高，重復(fù)性好。整個(gè)實(shí)驗(yàn)僅需15分鐘。操作簡(jiǎn)便、快速、 準(zhǔn)確、靈敏度高、直觀、結(jié)果容易判定。本發(fā)明結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)，可快速^f企測(cè)樣本中可能存在的豬偽 狂犬病毒抗體，達(dá)到快速檢測(cè)、及時(shí)控制疫情的目的，為下一步的分離鑒定創(chuàng)造了 有利條件，節(jié)省了大量的人力物力，方便、快速、簡(jiǎn)便，不需特殊儀器設(shè)備，不需 專業(yè)培訓(xùn)，結(jié)果清晰易辨；操作簡(jiǎn)單、易于推廣、適合基層以及突發(fā)事件的大批量 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病調(diào)查，對(duì)豬偽狂犬病毒感染診斷起到輔助作用。


圖l 本發(fā)明試紙條的正面示意圖； 圖2 本發(fā)明試紙條的側(cè)面示意圖；圖3檢測(cè)結(jié)果示意圖從左至右依次為檢測(cè)線和對(duì)照線顯色為陽性；對(duì)照 線顯色為陰性；檢測(cè)線和對(duì)照線兩條帶未顯色為無效。附圖標(biāo)記說明l-吸水墊；2-硝酸纖維膜(6-包被基因工程表達(dá)豬偽狂犬gE蛋 白；7-包被兔抗豬偽狂犬抗體)；3-含有膠體金標(biāo)記抗原的玻璃纖維膜；4-樣品墊； 5-反應(yīng)支持物。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述 而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方 案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1 本發(fā)明檢測(cè)抗體試紙條的制備 1基因工程表達(dá)豬偽狂犬gE蛋白制備(1)材料來源PRV閩A毒抹，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供。受體菌BL21由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；pMD18-T載體、各 種限制性內(nèi)切酶及修飾酶、pGEX-6P-l、 Trizol試劑盒等均購于大連寶生物公司； GST標(biāo)簽純化試劑盒購于Mersham Biosciences公司；IPTG、氨千青霉素購自上海 生工。(2 ) 病毒DNA的提取和基因的RT-PCR擴(kuò)增 DNA的提取按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行；根據(jù)GeneBank中豬偽狂犬病毒設(shè)計(jì) 一對(duì)針對(duì)PRV gE基因的特異性引物upper, 5、- CGGATCCCCGAGCCTCTCCGC CGAGAC-3、， lower, 5-GAAGGCGGGTCAGGCGGTC AG-3、反轉(zhuǎn)錄按反轉(zhuǎn)錄試劑 盒說明書進(jìn)行。取5/a1 cDNA產(chǎn)物用作PCR反應(yīng)。含有SalI位點(diǎn)；擴(kuò)增片段大小約 為l.Okb。(3 ) gE基因PCR擴(kuò)增及克隆50/il反應(yīng)體系中加5pl 10xLApCRTMBufferII (含Mg") 、 2U TaKaRa LATaq DNA聚合酶、0.4pmol/L引物、200|xmol/L dNTPs、 1^1模板。循環(huán)參數(shù)為95。C預(yù) 變性5min， 94°C/50sec， 68°C/50sec, 72°C/2min， 35個(gè)循環(huán),最后72。C延伸10min。 將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后所得細(xì)菌。(4) 表達(dá)載體的構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sail雙酶切pMD-gE,回收gE基因和同樣處理的 原核表達(dá)載體pGEX-6P-l連接，轉(zhuǎn)化BL21菌。堿裂解法小量提取質(zhì)粒，BamHI/XhoI 雙酶切篩選陽性重組質(zhì)粒，并命名為pGEX-gE。(5) gE基因的誘導(dǎo)表達(dá)將含有重組質(zhì)粒pGEX-gE的BL21菌種在含氨芐青霉素的LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落，于含Amp的LB中37。C搖床培養(yǎng)至00600為0.6-0.7時(shí)， 加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.6mM/L，繼續(xù)于25-37。C振搖培養(yǎng)3.5小時(shí)，收獲細(xì)菌。 離心后將菌體用0.5mol/LNaCl、 20mmol/L Tris《1 (pH-7.6)洗兩次，然后用PBS 懸浮細(xì)月包。(6) PRVgE蛋白純化用吸管將處理好的樣品加入GST親和層析柱中，控制流速使其在范圍 0.2-1 ml/min內(nèi)。加入10倍柱床體積的酶切緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl， 150 mmol/L NaCl， lmmol/LEDTA, lmmol/LDTT, pH7.5)洗滌一次，允許柱床排干；同時(shí) 準(zhǔn)備酶混合物，每lml柱床體積將80/^1 ( 160U)的酶混入920^1酶切緩沖液中，將 酶混合物加入柱中，封閉柱子后5。C消化4h以上；加入3倍柱床體積的酶切緩沖液 洗脫目的蛋白。2制備兔抗豬偽狂犬高免血清用豬偽狂犬弱毒抗原(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)釆用多點(diǎn)注射法免疫 陰性家兔3只，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，共進(jìn)行3次，最后一次免疫10天后采血，分離 血清，純化后得兔抗豬偽狂犬IgG。3膠體金顆粒制備將氯化金(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)配制成0.01%水溶液，取100ml煮 沸2min后，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉(1% ) 2 ml,煮沸至溶液顏色變成酒紅色后， 繼續(xù)煮沸至適宜濃度(OD535 =0.9312 ),冷卻后加入雙蒸餾水恢復(fù)到原體積，置4。C 保存。4膠體金標(biāo)記gE蛋白制備及純化將待標(biāo)記蛋白倍比稀釋，分別取100/il加入l ml膠體金中，10min后加入10% NaCllOOpl, 4。C靜止lh。取膠體金顏色沒有發(fā)生改變的最高稀釋倍數(shù)為準(zhǔn)，在此基 礎(chǔ)上加30%為最佳標(biāo)記量。取一定量調(diào)配好的膠體金用0.2 mo1/ L K2C03調(diào)至pH = 9.0,按最佳標(biāo)記量加入表達(dá)抗原，室溫作用20 min，加入Tris-HCl (pH 8.0， 20 mmo1/ L)配制的BSA,使終濃度為1%， 4。C放置2h后使用。將金標(biāo)抗原3000 r/min離心 30min,取上清，60000g離心60 min,沉淀用0.02 mo1/L pH7.2含O.l % BSA的PBS 溶解，恢復(fù)到原體積。再超離l次，沉淀用少許上述PBS溶解，使OD535nn^ 1.5。 0.22/mi濾膜過濾，4。C保存?zhèn)溆谩?、試紙條的組裝(1 )用噴膜機(jī)將膠體金標(biāo)記的豬偽狂犬gE蛋白復(fù)合物噴涂在玻璃纖維膜上，備用；
(2) 將豬偽狂犬gE蛋白和兔抗豬偽狂犬病毒IgG依次間隔3-5mm噴在硝酸纖 維膜上，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結(jié)合位點(diǎn)， 洗滌，干燥，備用；
(3) 將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘貼在支持 板上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素 膜上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙;^反連接在硝酸 纖維素膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；
(4)將粘好的支持板材料切成60mm長(zhǎng)、4mm寬的試紙條，即得。
試驗(yàn)例1 本發(fā)明快速檢測(cè)試紙條的相關(guān)試驗(yàn) 試驗(yàn)材料
豬偽狂犬強(qiáng)毒閩A抹，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；
高免血清的制備用豬偽狂犬病毒抗原，用不同劑量、間隔一定時(shí)間、用多點(diǎn) 注射法多次免疫陰性健康豬4頭，最后1次免疫IO后天采血；
參考病毒血清豬流行性腹瀉病毒(PEDV)陽性血清、豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血清、豬細(xì)小病毒(PPV)陽性血 清，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī) 研究所流行病學(xué)與診斷中心提供；分離血清。
待檢血清采自黑龍江、天津、福建等全國(guó)各地36個(gè)豬場(chǎng)的1285頭份血清和 全血(其中460頭為假設(shè)健康豬被采豬全血)，雞血清、鴨血清、鵝血清、羊血清 各15份，共計(jì)825份血清和460份全血。并把上述血清、全血編號(hào)待檢；
對(duì)照試劑盒ELISA和SN由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。
一 、本發(fā)明試紙條壽文感性試驗(yàn)
應(yīng)用本發(fā)明試紙條(實(shí)施例1所制備)對(duì)已知高免陽性血清進(jìn)行檢觀'J，與ELISA 進(jìn)4亍比專交。
將高免陽性血清作l:50倍稀釋后，按2倍進(jìn)行遞減稀釋，然后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 同一份PRV陽性高免血清，間接ELISA檢測(cè)，最低檢出量為1:3200-6400,用本發(fā) 明試紙條(GICA)進(jìn)行檢測(cè)，最低檢出量為1:3200。本發(fā)明膠體金免疫試紙條敏感 性比ELISA 4氐一個(gè)稀釋度。用本發(fā)明膠體金試紙條、ELISA試劑盒和中和試驗(yàn)，分別對(duì)上述1285份血清 和全血進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果基本一致，其中，825份豬血清中陽性72份，陰性753份。 在作上述中和試驗(yàn)時(shí)，825份豬血清中，滴度在1:16以上的樣品61份，滴度在1:16 以下的樣品6份。
二、 本發(fā)明試紙條特異性試驗(yàn) 向配制好的基因表達(dá)蛋白金標(biāo)溶液中加入豬流行性腹瀉病毒(PEDV)陽性血
清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血清、豬 細(xì)小病毒(PPV)陽性血清、豬圓環(huán)病毒陽性血清，進(jìn)行特異性檢測(cè)。結(jié)果用豬圓 環(huán)病毒(PCV)陽性血清、豬流型性腹瀉病毒(PEDV)陽性血清、豬傳染性胃腸 炎病毒(TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血清、豬瘟陽性血清、豬細(xì) 小病毒(PPV)陽性血清進(jìn)行GICA檢測(cè)均不出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，而用純化的PRV陽性 高免血清和未純化的PRV陽性血清則出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)。
三、 批內(nèi)和批間的重復(fù)性試驗(yàn)
批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)3份陰陽血清樣品在同一批次試紙條試驗(yàn)中每份樣品平行設(shè) 6個(gè)重復(fù)；批間重復(fù)性試驗(yàn)在5個(gè)不同試驗(yàn)日重復(fù)測(cè)定6批產(chǎn)品。試驗(yàn)結(jié)果為 批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為2.75-7.6%之間；批間重復(fù)變異系數(shù)為4.1-9.3%之間。
四、 符合率試驗(yàn)
用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供ELISA診斷試劑盒和中和試驗(yàn)，將上 述885份血清作1:40倍稀釋后，按2倍進(jìn)行遞減稀釋，然后進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行結(jié)果判 定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用本發(fā)明膠體金試紙條檢測(cè)與用ELISA、中和試驗(yàn)兩種方法檢 測(cè)的符合率分別為98.63%和95.83%。用本發(fā)明膠體金抗體檢測(cè)試紙條對(duì)上述采豬 場(chǎng)的460份血液進(jìn)行檢測(cè)，并把檢測(cè)結(jié)果和對(duì)應(yīng)血清檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，結(jié)果完全 相符。
五、 保存期試驗(yàn)
2003年12月以來對(duì)保存的紙條試劑盒進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明，試劑盒保存期 均在2年以上。建議試劑盒在-20。C保存，有效期為12-18個(gè)月。
權(quán)利要求
1、一種快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒抗體的試紙條，其特征在于包括樣品墊(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(2)、吸水墊(1)和支持物(5)；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬偽狂犬gE蛋白包被而成的檢測(cè)線(6)和由兔抗豬偽狂犬病毒抗體包被而成的對(duì)照線(7)；所述的玻璃纖維膜結(jié)合有膠體金標(biāo)記的豬偽狂犬gE蛋白；玻璃纖維膜、硝酸纖維膜和吸水墊按照以下次序相連接并附著在支持物上玻璃纖維膜與靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線(6)的一端相連接，吸水墊與靠近硝酸纖維膜對(duì)照線(7)的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相銜接。
2、 按照權(quán)利要求l所述的試紙條，其特征在于所述的支持物(5)是塑料板、 石更紙纟反或鋁4反。
3、 按照權(quán)利要求l所述的試紙條，其特征在于所述的兔抗豬偽狂犬抗體按照 以下方法制備得到用豬偽狂犬弱毒抗原采用多點(diǎn)注射法免疫陰性家兔3只，每隔2 周加強(qiáng)免疫l次，共進(jìn)行3次，最后一次免疫10天后采血，分離血清，純化后，即得。
4、 按照權(quán)利要求l的試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜能夠由尼龍膜 替換。
5、 按照權(quán)利要求l的試紙條，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和對(duì) 照線之間的間隔為3-5mm。
6、 按照權(quán)利要求5的試紙條，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和對(duì) 照線之間的間隔為4mm。
7、 一種制備權(quán)利要求l所述的檢測(cè)豬偽狂犬病毒抗體的試紙條的方法，包括 (1 )用噴膜機(jī)將膠體金標(biāo)記的豬偽狂犬gE蛋白復(fù)合物噴涂在玻璃纖維膜上，備用；(2 )將豬偽狂犬gE蛋白和兔抗豬偽狂犬抗體依次間隔3-5mm噴在硝酸纖維膜 上，分別作為檢測(cè)線和對(duì)照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結(jié)合位點(diǎn)，洗 滌，干燥，備用；(3)將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘貼在支持 板上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測(cè)線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素 膜上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在硝酸 纖維素膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；(4 )將粘好的支持板材料切成60mm長(zhǎng)、4mm寬的試紙條，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)豬偽狂犬病毒抗體的試紙條及其制備方法。本發(fā)明試紙條由樣品墊(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(2)、吸水墊(1)和支持物(5)組成；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬偽狂犬gE蛋白包被而成的檢測(cè)線(6)和由兔抗豬偽狂犬病毒抗體包被而成的對(duì)照線(7)；所述的玻璃纖維膜結(jié)合有膠體金標(biāo)記的豬偽狂犬gE蛋白。本發(fā)明試紙條可以大批量制備，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低廉；可快速檢測(cè)樣本中可能存在的豬偽狂犬抗體，靈敏度高、重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、直觀、結(jié)果容易判定，適合基層以及突發(fā)事件的大批量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，適合流行病調(diào)查，對(duì)豬偽狂犬病毒感染診斷起到輔助作用。
文檔編號(hào)G01N33/571GK101216492SQ20081000044
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者崔尚金 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所