模擬原核途徑的植物自固氮的制作方法
【專利說明】
[0001] 與相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年7月25日提交的美國臨時申請?zhí)?1/858, 218和2012年12 月3日提交的美國臨時申請?zhí)?1/732, 490的優(yōu)先權(quán)，所述每個臨時申請以其全部內(nèi)容通過 參考并入本文。
技術領域
[0003] 本公開涉及一種新的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物通過靶向或表達細菌的 nif(固氮）基因以產(chǎn)生固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白，并通過導入編碼與固氮酶的結(jié)構(gòu)蛋白同源的蛋 白質(zhì)的合成DNA序列，來復制光合細菌例如藍細菌或其他細菌的固氮機制，還涉及產(chǎn)生這 樣的植物的方法。
【背景技術】
[0004] 植物是屬于植物界的活生物體。所有高等植物具有維管組織木質(zhì)部（主要運輸水 和礦物質(zhì)）和韌皮部（主要運輸糖類和其他代謝物）。維管植物包括所有具種子的植物（裸 子植物和被子植物）和蕨類植物（包括羊齒類植物、石松類植物和木賊類植物），其也被稱 為導管植物。它們是具有有組織的細胞結(jié)構(gòu)的真核生物，所述細胞結(jié)構(gòu)包括核（在大多數(shù) 細胞中）和具有在光合作用期間使用光例如日光作為能源進行碳固定的能力的葉綠體（或 其他類型的質(zhì)體）。其他類型的植物包括例如藻類、苔蘚和真菌。
[0005] 農(nóng)業(yè)作物的作物生產(chǎn)率的總體限制因素是土壤和水中的氮含量。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)試 圖與增長的人口的不斷增加的需求和減少的可用耕地保持同步，這種元素的供應隨時間減 少。氮是所有生命形式、包括植物必需的重要營養(yǎng)物之一。然而，氮必須首先被轉(zhuǎn)變成植物 可以利用的形式。生物固氮（BNF)現(xiàn)象是使用固氮酶將大氣中的氮（N2)轉(zhuǎn)變成氨（NH3)。 BNF通常由下列化學反應式表示：N2+8H++8ell6ATP?>2NH3+H2+16ADP+16Pi，或者說在8個 質(zhì)子和8個電子存在下并消耗16個ATP分子（三磷酸腺苷一一細胞的能量分子），將氮氣 分子還原成兩個氨分子。由于隊含有叁鍵，這個反應消耗大量能量。氮氣分子中的鍵能約 為225kcal/mol。在自然界中，很少有BNF作為構(gòu)成"固氮酶復合體"的植物與幾個細菌物 種之間的共生關系的結(jié)果而進行。固氮酶復合體由兩種蛋白構(gòu)成：Fe蛋白（被稱為Nif-H 的酶）和Mo-Fe蛋白（被稱為Nif-D-K的a和0亞基）。固氮酶復合體由與同二聚體 (至少兩個相同單元）的Fe(鐵輔因子）蛋白暫時結(jié)合的異四聚體（不是相同單元）的 MoFe(鐵-鉬輔因子）蛋白構(gòu)成。
[0006]Nif-H基因編碼鐵蛋白，Nif-D和K基因編碼鉬鐵蛋白。因此，Nif-D和Nif-K基 因在它們的最終活性形式中需要Mo和Fe作為輔因子。Nif-D編碼Nif-D蛋白，也被稱為 a亞基，Nif-K編碼Nif-K的蛋白被稱為0亞基。換句話說，Nif-H是具有兩個相同亞基 的二聚體酶（總共2個蛋白），而Nif-D-K是2a20二聚體（總共4個蛋白）。所有6個 亞基對于其功能來說是必需和必要的。在自然界中，Nif-H具有大量變種，并對生物多樣性 有貢獻。存在大量類型的Nif-H這一事實，提供了適應各種不同自然條件的能力。
[0007] 產(chǎn)生固氮酶復合體的細菌物種包括固氮生物例如藍細菌、固氮菌科 (azotobacteraceae)、根瘤菌（rhizobia)和弗蘭克氏菌（frankia)。例如，在藍細菌中， Mo-Fe蛋白（Nif-D-K)結(jié)合大氣中的氮（N2)，然后Fe-蛋白（Nif-H)通過由鐵氧化還原蛋白 貢獻的電子將它還原。鐵氧化還原蛋白是在光合作用電子傳遞鏈中起到電子載體作用的蛋 白質(zhì)，其類似于高等植物葉綠體的Fe2S2鐵氧化還原蛋白，但不完全一致。被還原的Fe-蛋 白使用ATP將（被還原的）電子傳遞到Mo-Fe蛋白，后者然后將電子貢獻給N2 (固氮酶還 原酶）。通過將這個過程重復幾次，將N^N的所有三個共價鍵還原成2NH3。
[0008] 然而，僅有幾種植物物種可以與固氮生物以共生關系生活。例如，來自于豆科植物 的豌豆植物與來自于根瘤菌科的細菌共生生活。具體來說，根瘤菌細菌穿透豌豆植物的根， 產(chǎn)生含有固定氮（成為氨）的細菌的根瘤，而植物貢獻碳（糖）。因此，改進共生或擴展宿 主范圍對于植物存活來說是有益的，但實現(xiàn)這一目標包括許多挑戰(zhàn)，包括過程的復雜性和 基礎知識的欠缺。
[0009] 也可以使用人工方法將氮化學固定。這種固氮方法最通常通過被稱為Harber過 程的熱反應來生產(chǎn)。這個過程對于相對簡單的反應來說需要高的壓力和溫度。最近一百年 來，對氮肥的需求穩(wěn)定地增長到每年超過2億公噸。這種消耗量可能增加。
[0010] 非共生生物（例如與任何固氮微生物沒有確立的共生關系的自由生活的生物）， 如果各自包含核心酶固氮酶，可以實現(xiàn)自生物固氮（SBNF)。能夠自固氮的非細菌生物例如 作物和藻類以及其他植物的存在，對于幾種目的來說是有用的，例如降低施肥需求，降低施 肥污染，提供經(jīng)濟友好的作物生產(chǎn)，提高作物產(chǎn)量，提高植物中的油含量，提高植物中的蛋 白質(zhì)含量，降低水的氮污染，以及相對于氮提高碳含量和相對于土壤的有機相提高碳。然 而，出于幾個原因，沒有已知的能夠?qū)崿F(xiàn)這些結(jié)果的植物，其中一個原因是固氮酶的特殊酶 復合體，其包括幾種用于固氮的蛋白質(zhì)和基因。
[0011] 用于大氣氮固定的幾乎所有的核心酶都對氧非常敏感。這一特征使得幾乎不可能 在植物中固氮，因為植物在光合作用反應期間從水產(chǎn)生氧。藍細菌被認為是葉綠體的進化 祖先（基礎）。盡管葉綠體在進化期間已失去許多其原始的基因，但藍細菌維持了許多葉 綠體丟失的基因。作為光合生物，藍細菌棲息在地球上幾乎所有光照環(huán)境中。它們在由超 過20個固氮（NIF)基因促進的生物固氮（BNF)過程中發(fā)揮關鍵作用。這些基因中只有三 個（Nif-D、Nif-K和Nif-H)是NIF酶類（固氮酶）。其余的NIF基因參與復合體組裝、輔 因子加工和表達的控制。
[0012] 豆科作物例如大豆、菜豆或豌豆以它們發(fā)育出被根瘤菌（Rhizobiumsp.)共生細 菌占據(jù)的根瘤的獨特能力廣為人知。這些細菌能夠BNF并向植物提供氨。大多數(shù)作物不具 有這種能力，并且根瘤菌（Rhizobiumsp.)不能與它們相互作用。進行了幾次未發(fā)表的嘗 試以擴展根瘤菌的"宿主"范圍，但所有這些嘗試都失敗了。
[0013] 因此，需要一種系統(tǒng)和方法，其包含能夠以使系統(tǒng)可持續(xù)并且在商業(yè)上可行的顯 著速率進行細胞固氮以生產(chǎn)氨的轉(zhuǎn)基因植物。下面的部分描述這樣的系統(tǒng)。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本公開涉及被轉(zhuǎn)化以便能夠進行自行/自我固氮過程，產(chǎn)生它們自己可用的氮 源，由此降低對作為氮源的含氮肥料的依賴性的轉(zhuǎn)基因植物（遺傳修飾生物體或（GM0))。 本公開還涉及包含轉(zhuǎn)化這些植物以使它們能夠進行自行/自身固氮的基因的植物細胞、組 織、植物部分或植物株系。
[0016] 在某些實施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出改良的自身/自行固 氮情況的植物，其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將編碼可操作連接到啟動子序列和終 止子序列的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的重組核酸序列導入一個或多個植物細胞；從所述 植物細胞再生一株或多株植物，并選擇從所述植物細胞培養(yǎng)并表現(xiàn)出增強的固氮的一株或 多株植物，使得一株或多株植物包含編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列。 在某些實施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列從單一生物體獲 得。在某些實施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的所述重組核酸序列從不同生物 體獲得。例如，在某些實施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一個的重組核 酸序列從第一生物體獲得，并且編碼Nif-H、Nif-D和Nif-K基因中的至少一個的重組核酸 序列從不同于所述第一物種的第二生物體獲得。在某些實施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重組核酸序列在自然界中存在。在某些實施方式中，編碼Nif-H、Nif-D和 Nif-K基因的所述重組核酸序列是合成的并且在自然界中沒有被發(fā)現(xiàn)。
[0017] 在某些實施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出改良的自身/自行固 氮情況的植物，其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將植物細胞與編碼SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.NO. 2和SEQ.ID.NO. 3之一的重組核酸序列相接觸；從所述植物細胞再生一株或多株植 物；以及選擇從所述植物細胞培養(yǎng)的一株或多株植物，其中所選的植物各自表現(xiàn)出增強的 固氮，其中所選的一株或多株植物各自包含編碼SEQ.ID.No. 1、SEQ.ID.No. 2、SEQ.ID.N0. 3、 SEQ.ID.NO. 46、SEQ.ID.NO. 47、SEQ.ID.NO. 48 或SEQ.ID.NO49 的重組核酸序列。
[0018] 在某些實施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出增強的固氮的植物， 其通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將植物細胞與編碼SEQ.ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ. ID.NO. 3、SEQ.ID.NO46、SEQ.ID.NO47、SEQ.ID.NO48 或SEQ.ID.NO. 49 之一的重組核 酸序列相接觸；將所述植物細胞與被優(yōu)化以用于番茄葉綠體表達的至少一種合成的編碼 DNA序列（sCDS)相接觸；從所述植物細胞再生一株或多株植物；以及選擇從所述植物細 胞培養(yǎng)并表現(xiàn)出增強的固氮的一株或多株植物，其中所述一株或多株植物包含編碼SEQ. ID.N0. 1、SEQ.ID.N0. 2、SEQ.ID.N0. 3、SEQ.ID.N0 46、、SEQ.ID.N0 47、SEQ.ID.N0 48 或 SEQ.ID.NO. 49的所述重組核酸序列和所述s⑶S。
[0019] 在某些實施方式中，根據(jù)本公開的原理，提供了一種表現(xiàn)出增強的固氮的植物，其 通過包括下列步驟的方法來產(chǎn)生：將一個或多個植物細胞與編碼可操作連接到第一啟動 子的作為Nif-H基因的帶有植物轉(zhuǎn)運肽或葉綠體（質(zhì)體）積累信號的嵌合Nif基因的重 組核酸序列相接觸；將所述植物細胞與編碼可操作連接到第二啟動子的Nif-D基因的重組 核酸序列相接觸；將所述植物細胞與編碼可操作連接到第三啟動子的Nif-K基因的重組核 酸序列相接觸；從所述植物細胞再生一株或多株植物；以及選擇從所述植物細胞培養(yǎng)的一 株或多株植物，其中所選植物各自表現(xiàn)出增強的固氮，其中所選植物各自包含編碼Nif-H 基因的重組核酸序列、編碼Nif-D基因的重組核酸序列和編碼Nif-K基因的重組核酸序 列。在某些實施方式中，所述Nif-H基因選自基本上由SEQID.N0. 29、SEQID.N0. 32、SEQ ID.NO. 35和SEQID.NO. 38構(gòu)成的組。在某些實施方式中，所述Nif-D基因選自基本上由 SEQID.N0. 30、SEQID.N0. 33、SEQID.N0. 36 和SEQID.N0. 39 構(gòu)成的組。在某些實施方 式中，所述Nif-K基因選自基本上由SEQID.NO. 31、SEQID.NO. 34、SEQID.NO. 37 和SEQ ID.NO. 40構(gòu)成的組。在某些實施方式中，所述第一、第二和第三啟動子選自基本上由SEQ.ID.NO. 41-45構(gòu)成的組。
[0020] 本公開還涉及轉(zhuǎn)基因植物來源的商業(yè)化產(chǎn)品，其源自于按照本公開中描述的方法 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
[0021] 還描述了一種按照本公開的原理降低土壤中的總氮濃度的方法。所述方法包括將 本公開中描述的至少一種轉(zhuǎn)基因植物放置成與將要降低氮水平的土壤相接觸；以及允許所 述植物生長并固定從所述土壤獲得的氮，它們的代謝引起所述土壤中總氮濃度的降低。這 些以及其他原理使用附圖并在詳細描述中進一步描述。
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1示出了固氮酶復合體的示意結(jié)構(gòu)。
[0024]圖2示出了用于在番茄葉綠體轉(zhuǎn)化期間插入到質(zhì)體中的構(gòu)建質(zhì)粒的產(chǎn)生步驟的 示意圖。
[0025] 圖3示出了用于番茄葉綠體轉(zhuǎn)化和Nif-H、Nif-D和Nif-K基因的表達的質(zhì)粒（PGE 011)的產(chǎn)生步驟的示意圖。
[0026] 圖4示出了作為單一操縱子被克隆并插入到萊茵衣藻（C.reinhardtii)葉綠體中 的Nif-H、Nif-D和Nif-K基因。
[0027] 圖5不出了在萌發(fā)后三周時番前植株的發(fā)育。
[0028] 圖6示出了Nif-H在植物質(zhì)粒中的積累。
[0029] 圖7示出了植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的示意結(jié)構(gòu)。
[0030] 詳細描述
[0031] 本公開涉及能夠固氮的轉(zhuǎn)基因植物、從這樣的植物生產(chǎn)的產(chǎn)品、產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因 植物的方法和使用所述轉(zhuǎn)基因植物降低土壤或水