專利名稱：一種檢測豆科植物病毒的基因芯片、核苷酸序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豆科植物病毒的基因芯片、核苷酸序列及試劑盒，屬于檢驗檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
食品安全問題是一個歷史性的問題，也是一個全球化的問題。歷史上，由于缺少必要的檢測手段，使得病原生物從一地傳入另一地，從而造成傳入地的病原生物蔓延，給當(dāng)?shù)厝祟惖纳?、健康和農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)安全造成巨大的影響和損失。如著名的“愛爾蘭饑荒”就是由于從美洲引進(jìn)馬鈴薯，造成馬鈴薯晚疫病的大流行，僅有800萬人口的愛爾蘭島，就有20多萬人因饑荒而死亡，164萬人因饑荒而外逃。
在世界許多國家都曾出現(xiàn)過由病原生物引起植物源性食品的安全問題。如由麥角菌(Claviceps purpurra)引起的麥角病可使人們食用后發(fā)生中毒，并可以引起流產(chǎn)；20世紀(jì)40年代在美國流行的板栗疫病摧毀了全部的美洲板栗；1970年在美國大流行的玉米小斑病造成10億美元的損失；在非洲和美洲發(fā)生的柑橘速衰病(CTV)使得數(shù)百萬株柑橘樹死亡；在美國，每年由馬鈴薯X病毒引起的損失達(dá)總產(chǎn)量的10％左右。
就植物源性食品而言，往往一種植物源性食品可同時受到多種病原生物的侵染。如番茄，可受到80種真菌、11種細(xì)菌、16種病毒及一些菌植體的侵染；蘋果和馬鈴薯都可受到200種以上病原生物的侵染。
隨著經(jīng)濟(jì)全球化和世界食品貿(mào)易量持續(xù)增長(最新統(tǒng)計，目前全球食品貿(mào)易額約為每年5000億美元)危及食品安全的病原性疾病出現(xiàn)了新的特點流行速度快、影響范圍廣。在進(jìn)口的植物源性食品中，檢驗檢疫部門已檢出了危及植物源性食品的病原生物，如從進(jìn)口的大豆中檢出大豆疫病；從進(jìn)口的小麥中檢出TCK；從進(jìn)口的蔬菜中檢出辣椒輕斑駁病毒、黃瓜花葉病毒。
目前，我國出入境植物檢疫所采用的檢測技術(shù)手段相對比較落后，所采用的手段主要是口岸現(xiàn)場檢疫、生長季隔離檢疫、指示植物鑒定、血清學(xué)檢驗。這些手段存在的諸多不足1、耗時、費力且檢測周期長，不符合國務(wù)院提出的“加快通關(guān)速度”的精神；2、非特異性反應(yīng)是檢測過程中普遍出現(xiàn)的情況；3、有些病原生物(特別是植物病毒)缺乏有效的檢測手段。這些都不能適應(yīng)我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的需要。因此，建立新的快速有效的檢驗檢疫技術(shù)手段已經(jīng)迫在眉睫。
基因芯片技術(shù)是90年代中期以來快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)高新技術(shù)，是各學(xué)科交叉綜合的嶄新科學(xué)。其原理是將大量DNA探針片段有序地固化于支持物的表面，然后與已標(biāo)記的生物樣品中DNA分子雜交，再對雜交信號進(jìn)行檢測分析。它最大的優(yōu)點在于高通量、并行化和微型化。在基因芯片上，單位面積可以高密度地排列大量的生物探針，一次試驗就可以同時分析多種生物樣品?；蛐酒诤怂嵝蛄袦y定、基因突變的檢測、基因表達(dá)情況的分析等諸多領(lǐng)域的研究中得到了廣泛應(yīng)用，受到人們的普遍重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)實用的檢測豆科植物病毒的基因芯片。
本發(fā)明的第二個目的是提供一組檢測豆科植物病毒的核苷酸序列。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種可實現(xiàn)商品化的檢測豆科植物病毒的試劑盒。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種檢測豆科植物病毒的基因芯片，在固相載體表面固定有若干檢測和質(zhì)控對照探針，其中檢測探針具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列中的任意組合；質(zhì)控對照由表面化學(xué)對照探針、熒光標(biāo)記對照探針、陽性對照探針、陰性對照探針、雜交對照探針和空白對照組成。
所述的表面化學(xué)對照探針，為一段帶有熒光標(biāo)記的探針，優(yōu)選具有序列表SEQ IDNo.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修飾，3’端Cy3或Cy5修飾；其作用為監(jiān)控固相載體與探針的結(jié)合。
所述的熒光標(biāo)記對照探針，優(yōu)選為隨機(jī)生成一段與所有待檢病毒沒有同源性的序列，并據(jù)此序列設(shè)計標(biāo)記的對照探針，優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；熒光標(biāo)記對照的作用為監(jiān)控待檢樣品序列熒光標(biāo)記有效性，以確定產(chǎn)生的陰性信號是由于熒光標(biāo)記失敗引起還是由于樣品本身不含待檢病毒。
所述陽性對照探針，優(yōu)選為根據(jù)植物核糖體18S RNA序列設(shè)計，優(yōu)選具有序列表SEQID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；陽性對照的作用為監(jiān)控系統(tǒng)樣品RNA提取情況，如果陽性對照有信號就說明從植物中提取的總RNA質(zhì)量良好，病毒探針陰性信號是由于不含該病毒。
所述陰性對照探針，優(yōu)選為與所有病毒序列無同源性的60nt核苷酸序列，優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；陰性對照的作用為監(jiān)控反應(yīng)系統(tǒng)的污染情況，如果陰性對照探針有熒光信號則表明系統(tǒng)被污染。
所述雜交對照探針，為一條60nt序列，5’端氨基修飾，與固相載體結(jié)合，另合成一條與之互補(bǔ)配對的60nt序列，5’端Cy3或Cy5熒光標(biāo)記，作為試劑盒中雜交對照試劑。雜交對照探針優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，雜交對照試劑優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.86所示的序列；雜交對照的作用為監(jiān)控系統(tǒng)雜交反應(yīng)的有效性，如果雜交對照探針沒有信號說明是由于系統(tǒng)雜交反應(yīng)失敗，不能根據(jù)檢測探針的陰性信號判斷樣品中沒有該病毒。
所述空白對照，為點樣緩沖液，用于監(jiān)控點樣針清洗及探針有無交叉污染。
本發(fā)明中的固相載體可以選用本領(lǐng)域公知的載體，例如硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、載玻片等。
芯片每條探針橫向重復(fù)2點，每點的探針的量為0.002-0.02pmol，點直徑約180μm，點間距300μm。
所述芯片每張具有4個相同矩陣，探針排布方式為每個矩陣17行10列。
所述芯片片基(固相載體)、圍欄和蓋片購于北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司。
本發(fā)明以《中華人民共和國進(jìn)出境動植物檢疫法》所規(guī)定的必須實施檢疫的有害生物(病毒部分)為基礎(chǔ)，結(jié)合檢疫口岸各種病毒檢出的頻率統(tǒng)計、病毒的性質(zhì)(RNA病毒/DNA病毒)和國內(nèi)植物病毒爆發(fā)情況，確定以豆科植物的RNA病毒為檢測對象設(shè)計檢測芯片，豆科植物病毒檢測芯片上點制40種病毒的探針，具體名稱如下苜蓿花葉病毒(Alfalfamosaic virus，AMV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、黑眼豇豆花葉病毒(Blackeye cowpea mosaic virus，BlCMV)、豇豆花葉病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)、香石竹環(huán)斑病毒(Carnation ringspot virus，CRSV)、茄子花葉病毒(Eggplantmosaic virus，EMV)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus，LMV)、李矮縮病毒(Prunedwarf virus，PDV)、豌豆早枯病毒(Pea early-browning virus，PEBV)、李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)、花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)、懸鉤子環(huán)斑病毒(Raspberryringspot virus，RpRSV)、草莓潛環(huán)斑病毒(Strawberry latent ringspot virus，SLRSV)、南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus，SqMV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)、番茄黑環(huán)病毒(Tomato black ring virus，TBRV)、番茄叢矮病毒(Tomato bushystunt virus，TBSV)、煙草脆裂病毒(Tobacco rattie virus，TRV)、番茄斑萎病毒(Toma tospotted wilt virus，TSWV)、白三葉草花葉病毒(White clover mosaic virus，WClMV)、煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)、番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus，ToRSV)、李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、小西葫蘆花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaicvirus，SCMV)、白草花葉病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、菜豆普通花葉病毒(Bean common mosaicvirus，BCMV)、菜豆莢斑駁病毒(Bean pod mottle virus，BPMV)、豇豆重花葉病毒(Cowpeasevere mosaic virus，CPSMV)、蠶豆壞死黃化病毒(Faba bean necrotic yellows virus，F(xiàn)BNYV)、百合無癥病毒(Lily symptomless virus，LSV)、花生斑駁病毒(Peanut mottlevirus，PeMoV)、豌豆種傳花葉病毒(Pea seed borne mosaic virus，PSbMV)、大豆矮縮病毒(Soybean dwarf virus，SbDV)、南方菜豆花葉病毒(Southern bean mosaic virus，SBMV)、葡萄卷葉病毒-2(Grapevine leaf-roll associated virus 2，GLRaV-2)、木槿褪綠環(huán)斑病毒(Hibiscus chlorotic ringspot virus，HCRSV)。
芯片上各種豆科植物病毒的檢測探針根據(jù)GenBank公布的待檢病毒CP基因(植物病毒基因組中最保守的基因)序列設(shè)計，經(jīng)過同源性比對找出保守區(qū)段，再以比較嚴(yán)格且均一的條件(Tm值、GC含量、二級結(jié)構(gòu)等)計算出符合這些種病毒保守區(qū)段的60mer探針，并在5’端以氨基修飾，每種病毒設(shè)計兩條特異檢測探針，每條探針為60nt；表1 豆科植物病毒檢測探針序列



表面化學(xué)對照探針序列如表2(5’端氨基修飾，3’端Cy3或Cy5修飾)。
表2 表面化學(xué)對照探針序列(SEQ ID No.81)

熒光標(biāo)記對照探針序列如表3(5’端氨基修飾)。
表3 熒光標(biāo)記對照探針序列(SEO ID No.82)

陽性對照探針序列如表4。
表4 陽性對照探針序列(SEQ ID No.83)

陰性對照探針序列如表5(5’端氨基修飾)。
表5 陰性對照探針序列(SEQ ID No.84)

雜交對照探針序列如表6(5’端氨基修飾)。
表6 雜交對照探針序列(SEO ID No.85)

本發(fā)明提供了一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，由下述組分組成其中基因芯片、芯片蓋片和芯片雜交盒室溫貯存，其它試劑需-20℃貯存；(1)基因芯片、芯片蓋片和芯片雜交盒其中基因芯片的固相載體表面固定有若干探針和質(zhì)控對照，探針具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列；質(zhì)控對照由表面化學(xué)對照、熒光標(biāo)記對照、陽性對照、陰性對照、雜交對照和空白對照組成；其中，基因芯片的規(guī)格為25mm×75mm，每盒10-20片；基因芯片的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯或載玻片；基因芯片的表面化學(xué)對照，具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修飾，3’端Cy3或Cy5修飾；基因芯片的熒光標(biāo)記對照，具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；基因芯片的陽性對照具有序列表SEQ ID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；基因芯片的陰性對照具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；基因芯片的雜交對照具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，5’端氨基修飾；基因芯片的空白對照為點樣緩沖液；基因芯片的每條探針橫向重復(fù)2點，每點的探針的量為0.002-0.02pmol，點直徑約180μm，點間距300μm；基因芯片每張具有4個相同矩陣，探針排布方式為每個矩陣17行10列；(2)DEPC水428ul-856ul(3)反轉(zhuǎn)錄試劑405ul-810ul，購于Promega公司(4)反轉(zhuǎn)錄酶45ul-90ul，購于Promega公司(5)RNA酶抑制劑23ul-46ul，購于Promega公司(6)PCR酶15-30ul，購于TAKARA公司(7)40種病毒PCR引物及試劑每種423ul-846ul，在北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，包括蘋果褪綠葉斑病毒PCR試劑、苜蓿花葉病毒PCR試劑、南芥菜花葉病毒PCR試劑、菜豆普通花葉病毒PCR試劑、黑眼豇豆花葉病毒PCR試劑、菜豆莢斑駁病毒PCR試劑、黃瓜花葉病毒PCR試劑、豇豆花葉病毒PCR試劑、豇豆重花葉病毒PCR試劑、香石竹環(huán)斑病毒PCR試劑、茄子花葉病毒PCR試劑、蠶豆壞死黃花病毒PCR試劑、葡萄卷葉病毒-2 PCR試劑、木槿褪綠環(huán)斑病毒PCR試劑、萵苣花葉病毒PCR試劑、百合無癥病毒PCR試劑、李矮縮病毒PCR試劑、豌豆早枯病毒PCR試劑、花生斑駁病毒PCR試劑、白草花葉病毒PCR試劑、李屬壞死環(huán)斑病毒PCR試劑、李痘病毒PCR試劑、豌豆種傳花葉病毒PCR試劑、花生矮化病毒PCR試劑、懸鉤子環(huán)斑病毒PCR試劑、大豆矮縮病毒PCR試劑、南方菜豆花葉病毒PCR試劑、甘蔗花葉病毒PCR試劑、草莓潛環(huán)斑病毒PCR試劑、南瓜花葉病毒PCR試劑、番茄不孕病毒PCR試劑、番茄黑環(huán)病毒PCR試劑、番茄叢矮病毒PCR試劑、煙草花葉病毒PCR試劑、番茄環(huán)斑病毒PCR試劑、煙草環(huán)斑病毒PCR試劑、煙草脆裂病毒PCR試劑、番茄斑萎病毒PCR試劑、白三葉草花葉病毒PCR試劑、小西葫蘆花葉病毒PCR試劑；(8)陽性對照PCR引物及試劑423ul-846ul(9)標(biāo)記對照15ul-30ul(10)標(biāo)記PCR引物及試劑342ul-684ul(11)雜交對照45ul-90ul(12)2x雜交緩沖液495ul-990ul，購于Roche公司其中，(8)陽性對照PCR試劑的引物序列如表7。
表7 陽性對照引物序列

(9)標(biāo)記對照模板序列如表8(克隆至pMD-18T載體)。
表8 標(biāo)記對照模板序列(SEQ ID No89)

(10)標(biāo)記PCR試劑的標(biāo)記引物序列如表9。
表9 標(biāo)記引物序列

(11)雜交對照的序列如表10(5’端Cy3或Cy5修飾)。
表10 雜交對照序列(SEQ ID No86)

(7)40種病毒PCR試劑中的豆科植物病毒檢測引物序列如表11表11 豆科植物病毒檢測引物序列



基因芯片試劑盒的使用流程為植物總RNA的提取→RT-PCR→病毒特異性片段擴(kuò)增→標(biāo)記擴(kuò)增→雜交→清洗芯片→掃描→結(jié)果判讀。
上述所有的引物、探針、對照序列分別具有SEQ ID No1-SEQ ID No178所示的堿基序列，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的優(yōu)點和創(chuàng)新之處在于(1)高通量豆科植物病毒基因芯片和檢測試劑盒，整合了目前國家規(guī)定的豆科植物病毒檢驗檢疫領(lǐng)域最常見的豆科病毒的檢測序列和試劑，實現(xiàn)了對豆科植物中常見的40種病毒的同時檢測，實用性強(qiáng)；(2)快速檢測時間僅為1.5個工作日；(3)特異對探針序列進(jìn)行了嚴(yán)格篩選，使芯片上所有探針僅與其相對應(yīng)的某一種病毒的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)，有效避免了交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽性問題；(4)靈敏芯片的檢測靈敏度為108病毒顆粒/g組織樣品(大約相當(dāng)于1ng病毒核酸/g組織樣品)，比RT-PCR靈敏度高至少1～2個數(shù)量級；(5)反應(yīng)成本低采用了獨特設(shè)計的標(biāo)記引物序列5’-CACGAGGAGTCTGCTAC-3’進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)，將標(biāo)記反應(yīng)步驟中dNTP(1mM，含Cy3/Cy5-dCTP)的用量降到0.2μL，使反應(yīng)成本降至通用方法的7％左右，利于推廣應(yīng)用；(6)重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠經(jīng)過重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗證明該檢測系統(tǒng)可以保證檢測結(jié)果的重現(xiàn)性和精確性，可廣泛應(yīng)用于出入境檢驗檢疫系統(tǒng)的植物檢疫、植物源性食品安全監(jiān)察、植保站植物病毒病的診斷以及植物病毒分類學(xué)研究中病原體鑒定等領(lǐng)域。豆科植物病毒基因芯片檢測試劑盒可以用于600多種豆科植物源性食品的日常檢疫工作中。
下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。


圖1為芯片點樣區(qū)域的矩陣位置圖。
圖2為商品化的豆科植物病毒檢測基因芯片探針排列。
圖3-1為TRSV樣品RNA稀釋RT-PCR檢測結(jié)果圖。
圖3-2為TRSV樣品研磨液倍比稀釋ELISA檢測結(jié)果圖。
圖3-3至3-5為TRSV樣品RNA稀釋芯片檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式
實施例1、制備基因芯片一、材料和方法1、材料離心機(jī)購自Heraeus公司。
PCR儀購自Techne公司。
點樣儀購自GeneMachines公司，型號OminiGrid。
芯片裝配工具購自北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司。
雜交盒購自北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司。
芯片掃描儀購自Axon公司，型號GenePix4100A。
生物信息學(xué)及芯片分析軟件免費版本或試用版本，ClustalX1.83，VectorNTI9.1，ArrayDesigner2.02，GenePix Pro4.0(購自Axon公司)。
探針、引物、標(biāo)記對照模板見表1-表11，合成于北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
空白對照50％DMSO，購自Sigma公司。
片基醛基化玻璃片基，購自CEL公司和北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司。
點樣緩沖液50％DMSO。
點樣后洗液0.2％SDS。
點樣后封閉液0.2％NaBH1。
Trizol試劑購自Invitrogen公司。
反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。
TagDNA聚合酶購自Takara公司。
dNTP購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
Cy3/Cy5-dCTP購自Amersham Biosciences公司。
3X雜交緩沖液15×SSC，0.3％SDS，3×Blocking雜交洗液I(0.3×SSC，0.2％SDS)雜交洗液II(0.06×SSC)二、方法1、探針的設(shè)計與合成收集GenBank公布的待檢病毒CP基因(植物病毒基因組中最保守的基因)和植物的18S基因序列，經(jīng)過同源性比對找出保守區(qū)段，再以比較嚴(yán)格且均一的條件(Tm值、GC含量、二級結(jié)構(gòu)等)計算出符合這些種病毒保守區(qū)段的60mer探針，并在5’端以氨基修飾，每種病毒分別設(shè)計2條。本發(fā)明涉及的80條檢測豆科植物病毒的探針序列具有序列表SEQ ID.No.1-SEQ ID.No.80所示的核苷酸序列；表面化學(xué)對照，具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修飾，3’端Cy3或Cy5修飾；熒光標(biāo)記對照，為隨機(jī)生成一段與所有待檢病毒沒有同源性的序列，并據(jù)此序列設(shè)計標(biāo)記的對照探針，具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；
所述陽性對照，為根據(jù)植物核糖體18S RNA序列設(shè)計，監(jiān)控樣品RNA提取，具有序列表SEQ ID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；所述陰性對照，為與所有病毒序列無同源性的60nt核苷酸序列，具有序列表SEQ IDNo.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；所述雜交對照，具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，探針5’端氨基修飾；空白對照點樣緩沖液(50％DMSO)。
2、芯片的制備探針用點樣緩沖液溶解，濃度為50μM，每條探針橫向重復(fù)2點，每點約0.25nL，點直徑約180μm，點間距300μm，點樣均勻度的標(biāo)準(zhǔn)方差約為15％。
探針排布一張芯片上4個相同矩陣，矩陣位置如圖1所示。豆科芯片每個矩陣17行10列，探針排列如圖2所示。
點樣后洗片點樣后洗液中攪拌清洗2min；點樣后封閉液中攪拌封閉5min；去離子水中攪拌清洗2min，重復(fù)三次，2000rpm離心1min。
利用芯片裝配工具將四區(qū)域芯片圍欄貼于芯片表面，置于暗盒室溫保存。
實施例2、基因芯片的使用方法1.待測樣品總RNA的提取(推薦方法)取0.1g待測樣品，剪成小段，用液氮研磨成粉末狀，加入1mL的Trizol試劑繼續(xù)研磨勻漿，移入滅菌的1.5mL離心管中室溫靜置5min；4℃12000g(約12000rpm)離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入一新的1.5mL離心管中；加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，然后在室溫下保持2-3min后，4℃12000g(約12000rpm)離心15min；將上層水相(大約0.6mL)轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫下保持10min；4℃12000g(約12000rpm)離心10min，棄去上清液，加入1mL75％的乙醇(DEPC水配置)洗滌沉淀，然后4℃7500g(約10000rpm)離心5min，棄去乙醇；沉淀于室溫下干燥后，溶于20μL DEPC水中，-20℃保存RNA。
2.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系及程序如下待測樣品總RNA2μLDEPC水(D)7.5μL混合均勻后70℃10min→冰浴5min，然后加入反轉(zhuǎn)錄試劑(RT)9μLRNA酶抑制劑(I)0.5μL反轉(zhuǎn)錄酶(E) 1μL混合均勻后，室溫10min→42℃ 30min→95℃，5min→冰浴，-20℃保存cDNA。
3.特異性擴(kuò)增根據(jù)樣品感染病毒的可能和檢測需求選擇檢測的病毒種類，然后分別進(jìn)行不同病毒的特異性PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及程序如下逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 0.5μL需檢病毒或陽性對照PCR試劑 9.4μLPCR酶(PE) 0.1μL95℃ 5min 72℃ 10min4.標(biāo)記擴(kuò)增將待檢樣品的多個擴(kuò)增產(chǎn)物(包括需檢病毒和陽性對照的所有特異性PGR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物的管數(shù)記為N)混合均勻。反應(yīng)體系及程序如下特異性PCR產(chǎn)物混合物(N×0.05)μLDEPC水(D) (2-N×0.05)μL標(biāo)記PCR試劑(L) 7.6μLPCR酶(PE) 0.1μL標(biāo)記對照(LC) 0.3μL95℃ 5min 72℃ 10min
5.雜交反應(yīng)體系及程序如下標(biāo)記反應(yīng)產(chǎn)物10μL2×雜交緩沖液(2×HB)11μL雜交對照(HC)1μL95℃5min→冰浴5min芯片雜交盒中加入200μL去離子水，將芯片正面朝上放進(jìn)雜交盒中，對準(zhǔn)方向放入蓋片，通過加樣孔將變性后的雜交液取15μL一次性注入，使其充滿蓋片和芯片之間空隙，封閉雜交盒，置于65℃恒溫環(huán)境30min，同時于65℃恒溫環(huán)境中預(yù)熱雜交洗液I和雜交洗液II。
雜交完畢后，棄去蓋片，芯片探針面向下在少量預(yù)熱的雜交洗液I中漂去殘余雜交液(注意避免四個矩陣的雜交液交叉污染)，撕去芯片上的橡膠圍欄，在預(yù)熱的雜交洗液I攪拌清洗5min，再在預(yù)熱的雜交洗液II攪拌清洗5min，2000rpm離心1min，置于暗盒室溫保存。
6.掃描將芯片置于芯片掃描儀中進(jìn)行掃描分析，Cy3標(biāo)記用532nm激光管掃描(如未另外說明，該試劑盒中熒光標(biāo)記物均為Cy3)，Cy5標(biāo)記用635nm激光管掃描(如用戶需要可以提供熒光標(biāo)記物為Cy5的試劑盒)，PMT設(shè)為900。獲得各點熒光強(qiáng)度、背景強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。
7.結(jié)果判讀依據(jù)以下原則判讀檢測結(jié)果a.每個檢測點信號值＝該點熒光強(qiáng)度值-該點背景強(qiáng)度值；b.空白對照平均信號值＝2個空白對照點信號值的平均值；c.陰性對照平均信號值＝2個陰性對照點信號值的平均值-空白對照平均信號值；d.每條探針的每個檢測點信號值-空白對照平均信號值＞2倍陰性對照平均信號值即判讀該檢測點為陽性；e.每條探針的兩個重復(fù)檢測點均為陽性即判讀該條探針為陽性；e.每種病毒的一條以上探針為陽性即判讀待測樣品攜有該種病毒；f.如探針結(jié)合對照的27個點中任何一個為陰性，則表明探針與片基結(jié)合存在問題，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；g.如雜交對照為陰性，則表明雜交環(huán)節(jié)存在問題，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；h.如標(biāo)記對照為陰性，則表明標(biāo)記擴(kuò)增環(huán)節(jié)存在問題，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確；
i.如陽性對照為陰性，則表明總RNA提取環(huán)節(jié)存在問題，實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。
實施例3、芯片檢測靈敏度試驗一、方法將攜有煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)的植物樣品(北京出入境檢驗檢疫局提供)提取RNA，分別進(jìn)行101～103倍梯度稀釋，分別進(jìn)行RT-PCR檢測、ELISA(購于北京賽恩思科貿(mào)有限責(zé)任公司)和芯片檢測。
二、結(jié)果TRSV樣品RNA稀釋RT-PCR檢測結(jié)果見圖3-1，其中110-3稀釋；210-4稀釋；3.10-5稀釋；n空白對照；MMarker DL2000，只有10-3稀釋能夠檢出病毒。
TRSV樣品研磨液倍比稀釋ELISA檢測結(jié)果見圖3-2，TRSV樣品研磨液作1∶4稀釋時陽性信號值就接近臨界值，1∶8稀釋就判讀不出陽性。
TRSV樣品RNA稀釋芯片檢測結(jié)果見圖3-3至3-5，其中圖3-3為10-3稀釋，圖3-4為10-1稀釋，圖3-5為10-5稀釋，在10-4稀釋時依然能夠檢出病毒。
可見，用帶毒樣品雜交，芯片檢測靈敏度比RT-PCR法高了1-2個數(shù)量級，比ELISA檢測高4-5個數(shù)量級。
實施例5、芯片的穩(wěn)定性試驗一、方法將三張芯片分別于室溫放置，37℃放置1周，37℃放2周，用TRSV樣品RNA分別進(jìn)行雜交反應(yīng)。
二、結(jié)果實驗結(jié)果表明即使在37℃放置2周，依然不影響檢測結(jié)果，芯片具有很好的穩(wěn)定性。
實施例6、基因芯片在檢驗檢疫實務(wù)中的試用用研制的基因芯片對多種植物進(jìn)行病毒篩查，篩查結(jié)果與ELISA實驗比較，結(jié)果有差異的再用兩步法RT-PCR驗證。
一、材料和方法1、試驗材料大豆、四季豆、豇豆、南瓜、絲瓜、黃瓜、西葫蘆、番茄、甜椒、向日葵等種子以及百合種球和葡萄接穗取自北京出入境檢驗檢疫局植檢實驗室，這些種子、種球和接穗分別來自荷蘭、法國、美國、以色列和菲律賓。蘋果、桃、香瓜、油菜、莧菜、煙草、苦瓜、菠菜、蘿卜、玉米、分別來自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院植物隔離場和農(nóng)田。
本研究使用的TMV、SCMV、CMV、ZYMV、TRSV、ToRSV、PNRSV抗血清購自美國Agdia公司。
2、實驗方法(1)樣品的采集和前處理將西葫蘆、南瓜等植物種子種植于防蟲網(wǎng)室內(nèi)花盆中，待二葉期取植物葉片用于DAS-ELISA、PCR和芯片檢測，對于蘋果、葡萄接穗待展葉取柔嫩葉片檢測，百合種球直接取其組織檢測。田間植物樣品選取柔嫩葉片用于檢測。植物體組織總RNA提取方法見第一部分。
(2)DAS-ELISA檢測A.包被酶聯(lián)板用待測病毒抗血清的提純IgG(即一抗)，以使用工作濃度稀釋于包被緩沖液中，每孔加100μL稀釋的IgG。37℃孵育3個小時或者4℃冰箱中孵育過夜；B.洗板將反應(yīng)板快速反扣，棄去孔中液體于廢水容器中(注意不要讓孔與孔之間溶液相混以免發(fā)生交叉污染)，然后每孔加200μL PBST液，靜置3min后快速棄去孔中液體，如此重復(fù)至少3～5次；C.加樣除空白孔加100μL PBST+2％PVP緩沖液，其余每孔加100μL樣品抽提液，一個樣品設(shè)兩個重復(fù)，同時設(shè)陽性對照，陰性對照；加樣后于4℃冰箱中孵育過夜或37℃溫箱中保濕靜置2h；D.洗板同(2)；E.加酶標(biāo)IgG用PBST+2％PVP稀釋酶標(biāo)抗體(即二抗)至合適工作濃度，每孔樣品加100μL酶標(biāo)IgG；F.孵育37℃溫箱中靜置2h；G.洗板同(2)；H.加底物用底物緩沖液1mg/mL溶解底物PNP(現(xiàn)配現(xiàn)用)，每孔加100μL(含空白對照)；I.孵育室溫避光顯色30～60min；目測以顏色深淺記錄+++，++，±，-；或用酶聯(lián)讀數(shù)儀在405nm下讀數(shù)；J.讀數(shù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為，陽性I/H≥2，陰性I/H＜2。
I/H＝(樣品的平均吸光值-空白對照的平均吸光值)/(健康對照的平均吸光值-空白對照平均吸光值)K.注意均設(shè)置空白對照、陰性對照(即健康對照)和陽性對照；對酶聯(lián)板讀數(shù)或目測結(jié)果時應(yīng)及時，否則讀數(shù)不準(zhǔn)確。不能接觸PNP藥片(劇毒)或把PNP溶液曝露于強(qiáng)光下，光線或污染物能夠引起陰性孔呈現(xiàn)背景顏色。
(3)芯片檢測同實施例2。
(4)兩步法RT-PCR檢測第一步RT-PCR方法，用鑒定引物；第二步PCR用通用引物，方法見實施例2。將ELISA和芯片檢測存在差異的樣品用兩步法RT-PCR方法進(jìn)行再次驗證。
三、結(jié)果1、基因芯片篩查植物感病情況統(tǒng)計如表12所示。
表12 基因芯片篩查植物感病情況統(tǒng)計


2、ELISA篩查植物感病情況見表13。
表13 ELISA篩查植物感病情況統(tǒng)計


3、比較兩種方法在不同植物中檢出病毒的情況，結(jié)果如表14所示。
表14 兩種方法檢出植物帶毒情況比較

4、芯片檢測顯陽性而ELISA檢測顯陰性的樣品通過兩步法RT-PCR方法的驗證結(jié)果，證實了芯片的檢測結(jié)果是正確的。
根據(jù)以上實驗結(jié)果可知，基因芯片檢測結(jié)果與ELISA的檢測結(jié)果兩者具有一致性，凡是ELISA檢測出的病毒，用基因芯片也都能檢測出；對于植物中含量甚微的病毒，用ELISA方法檢測不出，用基因芯片卻能檢測到陽性信號，經(jīng)兩步RT-PCR驗證，樣品確實為陽性。說明基因芯片檢測技術(shù)比ELISA方法具有更高的靈敏度。基因芯片技術(shù)還能同時檢測一份樣品中存在的4種病毒，體現(xiàn)了芯片雜交技術(shù)的高通量和并行性。
實施例7、檢測試劑盒1.豆科植物病毒檢測基因芯片表15


室溫避光保存，貯存12個月不影響使用效果。
2.“豆科植物病毒基因芯片檢測試劑盒”表16


-20℃避光保存，貯存12個月不影響使用效果。
40種病毒PCR試劑中的豆科植物病毒檢測引物序列具有序列表SEQ ID N091至SEQID N0178所示的序列；陽性對照PCR試劑的引物序列具有序列表SEQ ID N087和SEQ IDNo88所示的序列；標(biāo)記對照模板序列具有序列表SEQ ID No89所示的序列；標(biāo)記PCR試劑的標(biāo)記引物序列具有序列表SEQ ID No90所示的序列；雜交對照的序列具有序列表SEQ ID No86所示的序列。
使用方法(同實施例2)本發(fā)明主要完成了用于豆科植物源性食品病毒檢測的基因芯片檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)選用醛基基片，通過實驗室優(yōu)化，形成穩(wěn)定的基因芯片制備工藝；通過優(yōu)化熒光標(biāo)記和芯片雜交裝置，形成成熟的反應(yīng)體系。
本發(fā)明研究結(jié)果表明，豆科植物源性食品病毒基因芯片檢測試劑盒可以用于600多種豆科植物源性食品的日常檢疫工作中。本發(fā)明改變了傳統(tǒng)的植物源性食品病毒檢疫方式，在植物源性食品病毒檢測技術(shù)中，引入了生物芯片技術(shù)，建立了多種病毒同時檢測的方法，極大地提高了檢測靈敏度和檢測效率，為加快出入境植物源性食品的通關(guān)速度、加大國家對食品安全的監(jiān)測力度提供了有力的保障。
序列表<110>中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局本元正陽基因技術(shù)股份有限公司中國檢驗檢疫科學(xué)研究院浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所<120>一種檢測豆科植物病毒的基因芯片、核苷酸序列及試劑盒<130>
<160>178<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>1tcactacaat gccagaggtt gggagtaaat acccggagct gatgtttgat ttcaataagg 60<210>2<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>2catgaacaag gctcagcaga aggtgataac taatatgaac cgtcgtcttt tacagactga 60<210>3<211>60<212>DNA
<213>人工合成<400>3ttgtctcact gatgacgtga cgactgagga tggtagggcc gttgcgcatg gtaatcccat 60<210>4<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>4tgagaagttc gggtttgagt tggtcttcac agctcctacc catgcgggaa tgcaaaatca 60<210>5<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>5ccttgatctt aagttaatgt gggatttgga gggtgagttt ggaaagagtt ctggtggtgt 60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>6tcctctacta ctagcactgt agcccttgga gacaatcctt ttgcccatat gatagcttgt 60<210>7<211>60
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<400>69ctttgcttat tggtatggat gttccgaagg atgagagact caaaccgtct aaggtgttgg 60<210>70<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>70ccaacacctt agacggtttg agtctctcat ccttcggaac atccatacca ataagcaaag 60<210>71<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>71cactggctgg cattatggtg aggtggatct ctgcatttct tggtcaaggt ctaaacaggc 60<210>72<211>60<212>DNA<213>人工合成<400>72tacaactgaa gaaggatttg gtagacttgg cattctccct ctttctggtc ccatagctcc 60<210>73<211>60<212>DNA
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權(quán)利要求
1.一種檢測豆科植物病毒的基因芯片，在固相載體表面固定有若干探針和質(zhì)控對照，其中探針選自具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列中的任意組合；質(zhì)控對照由表面化學(xué)對照、熒光標(biāo)記對照、陽性對照、陰性對照、雜交對照和空白對照組成表面化學(xué)對照，優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修飾，3’端Cy3或Cy5修飾；熒光標(biāo)記對照，優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；陽性對照優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；陰性對照優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；雜交對照優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，5’端氨基修飾；空白對照為點樣緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測豆科植物病毒的基因芯片，其特征在于所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯或載玻片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測豆科植物病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片每條探針橫向重復(fù)2點，每點的探針的量為0.002-0.02pmol，點直徑約180μm，點間距300μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種檢測豆科植物病毒的基因芯片，其特征在于所述芯片每張具有4個相同矩陣，探針排布方式為每個矩陣17行10列。
5.一組人工合成檢測豆科植物病毒的引物序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.178所示的序列中的一種或多種序列的組合。
6.一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，由下述組分組成其中基因芯片、芯片蓋片和芯片雜交盒室溫貯存，其它試劑需-20℃貯存；(1)基因芯片、芯片蓋片和芯片雜交盒其中基因芯片的固相載體表面固定有若干探針和質(zhì)控對照，探針選自具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列中的任意組合；質(zhì)控對照由表面化學(xué)對照、熒光標(biāo)記對照、陽性對照、陰性對照、雜交對照和空白對照組成；(2)DEPC水；(3)反轉(zhuǎn)錄試劑；(4)反轉(zhuǎn)錄酶；(5)RNA酶抑制劑；(6)PCR酶；(7)40種病毒PCR引物及試劑每種423ul-846ul，包括蘋果褪綠葉斑病毒PCR試劑、苜蓿花葉病毒PCR試劑、南芥菜花葉病毒PCR試劑、菜豆普通花葉病毒PCR試劑、黑眼豇豆花葉病毒PCR試劑、菜豆莢斑駁病毒PCR試劑、黃瓜花葉病毒PCR試劑、豇豆花葉病毒PCR試劑、豇豆重花葉病毒PCR試劑、香石竹環(huán)斑病毒PCR試劑、茄子花葉病毒PCR試劑、蠶豆壞死黃花病毒PCR試劑、葡萄卷葉病毒-2PCR試劑、木槿褪綠環(huán)斑病毒PCR試劑、萵苣花葉病毒PCR試劑、百合無癥病毒PCR試劑、李矮縮病毒PCR試劑、豌豆早枯病毒PCR試劑、花生斑駁病毒PCR試劑、白草花葉病毒PCR試劑、李屬壞死環(huán)斑病毒PCR試劑、李痘病毒PCR試劑、豌豆種傳花葉病毒PCR試劑、花生矮化病毒PCR試劑、懸鉤子環(huán)斑病毒PCR試劑、大豆矮縮病毒PCR試劑、南方菜豆花葉病毒PCR試劑、甘蔗花葉病毒PCR試劑、草莓潛環(huán)斑病毒PCR試劑、南瓜花葉病毒PCR試劑、番茄不孕病毒PCR試劑、番茄黑環(huán)病毒PCR試劑、番茄叢矮病毒PCR試劑、煙草花葉病毒PCR試劑、番茄環(huán)斑病毒PCR試劑、煙草環(huán)斑病毒PCR試劑、煙草脆裂病毒PCR試劑、番茄斑萎病毒PCR試劑、白三葉草花葉病毒PCR試劑、小西葫蘆花葉病毒PCR試劑；(8)陽性對照PCR引物及試劑；(9)標(biāo)記對照；(10)標(biāo)記PCR引物及試劑；(11)雜交對照；(12)2x雜交緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(1)基因芯片的規(guī)格為25mm×75mm，每盒10-20片。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(1)基因芯片的固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯或載玻片。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(1)基因芯片的表面化學(xué)對照，優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.81所示的核苷酸序列，其5’端氨基修飾，3’端Cy3或Cy5修飾；熒光標(biāo)記對照，優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.82所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；陽性對照優(yōu)選具有序列表SEQ IDNo.83所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；陰性對照優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.84所示的核苷酸序列，5’端氨基修飾；雜交對照優(yōu)選具有序列表SEQ ID No.85所示的序列，5’端氨基修飾；空白對照為點樣緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(1)基因芯片的每條探針橫向重復(fù)2點，每點的探針的量為0.002-0.02pmol，點直徑約180μm，點間距300μm。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(1)基因芯片每張具有4個相同矩陣，探針排布方式為每個矩陣17行10列。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11中任何一項所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(7)40種病毒PCR試劑中的豆科植物病毒檢測引物序列具有序列表SEQ ID No91至SEQ ID No178所示的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求6至11中任何一項所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(8)陽性對照PCR試劑的引物序列具有序列表SEQ IDNo87和SEQ ID No88所示的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求6至11中任何一項所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(9)標(biāo)記對照模板序列具有序列表SEQ ID No89所示的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求6至11中任何一項所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(10)標(biāo)記PCR試劑的標(biāo)記引物序列具有序列表SEQID No90所示的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求6至11中任何一項所述的一種可直接應(yīng)用于檢疫工作的豆科植物病毒的試劑盒，其特征在于所述(11)雜交對照的序列具有序列表SEQ ID No86所示的序列。
全文摘要
一種檢測豆科植物病毒的基因芯片，在固相載體表面固定有若干探針和質(zhì)控對照，其中探針具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.80所示的核苷酸序列；質(zhì)控對照由表面化學(xué)對照、熒光標(biāo)記對照、陽性對照、陰性對照、雜交對照和空白對照組成。本發(fā)明的優(yōu)點和創(chuàng)新之處在于實用性強(qiáng)、快速、特異、靈敏、反應(yīng)成本低、重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。經(jīng)過重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗證明該檢測系統(tǒng)可以保證檢測結(jié)果的重現(xiàn)性和精確性，可廣泛應(yīng)用于出入境檢驗檢疫系統(tǒng)的植物檢疫、植物源性食品安全監(jiān)察、植保站植物病毒病的診斷以及植物病毒分類學(xué)研究中病原體鑒定等領(lǐng)域。豆科植物病毒基因芯片檢測試劑盒可以用于600多種豆科植物源性食品的日常檢疫工作中。
文檔編號C12Q1/68GK1952648SQ200610081219
公開日2007年4月25日 申請日期2006年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者汪琳, 吳小兵, 相寧, 周雪平, 周琦, 任魯風(fēng), 馬新穎, 高文娜, 李明福, 鄧叢良, 王欣月, 張永江, 汪萬春, 種焱, 王甲正, 何新舟, 于翠, 吳建祥 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局, 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所, 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所, 本元正陽基因技術(shù)股份有限公司