-丙烯酰基-l-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯酰基-L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]與體內(nèi)三維環(huán)境中的細(xì)胞相比，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)板進(jìn)行二維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞形態(tài)、生長增殖、基因表達(dá)、對(duì)外源信號(hào)應(yīng)答等方面均有所變化，難以客觀、真實(shí)的反映體內(nèi)細(xì)胞的生長行為和功能。宄其原因主要是，二維培養(yǎng)環(huán)境無法準(zhǔn)確為細(xì)胞提供體內(nèi)細(xì)胞所處的三維微環(huán)境，無法完全重現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞/細(xì)胞間和細(xì)胞/基質(zhì)間的相互作用，造成兩種環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞生長行為和功能的明顯差異。因此，為更大程度地模擬腫瘤細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境，利用水凝膠和多孔支架材料實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的三維培養(yǎng)，在體外構(gòu)建腫瘤三維模型，有望更準(zhǔn)確地模仿體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為、揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及評(píng)價(jià)腫瘤藥物療效等。目前，三維細(xì)胞培養(yǎng)正逐漸成為抗腫瘤治療研宄的主要技術(shù)手段。相對(duì)于剛性較大的聚酯類生物材料制備的泡孔狀和纖維狀結(jié)構(gòu)支架，水凝膠在構(gòu)建軟組織腫瘤模型中更具優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在能原位包埋細(xì)胞、模量調(diào)節(jié)范圍大、孔徑適合、透光性好、可無損害或最小損害方式注射至體內(nèi)等，可始終維持細(xì)胞/細(xì)胞間和細(xì)胞/基質(zhì)間良好的接觸，是真正意義上的三維培養(yǎng)[Seliktar D.Designing cell-compatible hydrogels for b1medicalapplicat1ns.Science, 2012, 336:1124-1128]。
[0003]透明質(zhì)酸是人體細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，由其形成的水凝膠具有優(yōu)異的生物相容性、高吸水性、可生物降解性等性能，微觀結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)高度相似，可為細(xì)胞提供理想的三維生長環(huán)境，近年來在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。已有研宄表明，透明質(zhì)酸水凝膠能夠支持細(xì)胞生長，維持細(xì)胞正常表型、活性、增殖、迀移和分化等行為，并且這些生長行為與水凝膠微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能密切相關(guān)[Lawyer T,Mcintosh K,Clavijo C，et al.Formulat1n changes affect materialproperties and cell behav1r in HA—based hydrogels.1nternat1nal JournalCell B1logy, 2012, 2012:Article ID737421，ppl_9]。水凝膠黏彈性行為反映其強(qiáng)度大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好壞，決定水凝膠能否為細(xì)胞生長提供一個(gè)理想的微環(huán)境，并對(duì)細(xì)胞生長行為具有重要影響。然而，單純的透明質(zhì)酸水凝膠存在如下不足，如力學(xué)性能差、體內(nèi)降解速度過快等，難以滿足細(xì)胞三維培養(yǎng)的性能要求。因此，利用其他材料復(fù)合改性透明質(zhì)酸水凝膠就成為研宄的重點(diǎn)，如利用硫酸軟骨素或殼聚糖改性透明質(zhì)酸制備的復(fù)合水凝膠，可顯著改善力學(xué)性能和降低降解速度等[Ni YL, Tang ZR, Cao WX, etal.Tough and elastic hydrogel of hyaluronic acid and chondroitin sulfateas potential cell scaffold materials.1nternat1nal Journal of B1logicalMacromolecules, 2015, 74:367-375 ；Kaderli S, Boulocher C, Pillet E, et al.A novelb1compatible hyaluronic acid—chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosistherapy.1nternat1nal Journal of Pharmaceutics, 2015，483:158-168]。賴氨酸是人體必需氨基酸之一，為堿性氨基酸，能夠促進(jìn)細(xì)胞的粘附和生長。近幾年，以賴氨酸及其衍生物為原料合成的多肽材料和側(cè)鏈為賴氨酸的聚合物材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到關(guān)注[Johnson NR, Ambe T, Wang YD.Lysine-based polycat1n: heparin coacervate forcontrolled protein delivery.Acta B1materialia, 2014, 10:40-46 ；Lyu SRy, Kuo YC, KuHF,et al.Cryopreserved chondrocytes in porous b1materials with surface elastinand poly-l-lysine for cartilage regenerat1n.Colloids and Surfaces B:B1interfaces, 2013，103:304-309]。其中，制備含賴氨酸或其衍生物的水凝膠是一個(gè)比較有前景的發(fā)展方向，但這類水凝膠脆性大、易破碎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠及其制備方法。該方法以甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸和Νε-丙烯酰基-L-賴氨酸為基本原料，采用兩步光化學(xué)聚合方法制備出透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，制得的水凝膠具有可生物還原、強(qiáng)度高、生物相容性優(yōu)異等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0007]I)甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸的制備:
[0008]配制透明質(zhì)酸水溶液，再向其中依次加入用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)0.24?0.72倍的N-羥基琥珀酰亞胺、2?10倍的胱胺和0.2?0.6倍的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后將pH值調(diào)至5.0?5.5，在室溫下攪拌反應(yīng)24?60小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系依次經(jīng)透析和冷凍干燥，得到胱胺改性的透明質(zhì)酸；
[0009]配制胱胺改性的透明質(zhì)酸水溶液，再向其中加入用量為透明質(zhì)酸重復(fù)單元摩爾數(shù)0.1?0.4倍的甲基丙烯酸縮水甘油酯，然后將pH值調(diào)至8.0，在65°C?85°C下攪拌反應(yīng)3?8小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系依次經(jīng)透析和冷凍干燥，得到甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸；
[0010]2)透明質(zhì)酸水凝膠的制備:
[0011]配制甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸水溶液，再向其中加入甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸質(zhì)量
0.2%?1%的水溶性光引發(fā)劑，混合均勻后實(shí)施光化學(xué)聚合，得到透明質(zhì)酸水凝膠，經(jīng)冷凍干燥后備用；
[0012]3)透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠制備:
[0013]按質(zhì)量比為(100?200):(5?20):1配制Ne-丙烯酰基-L-賴氨酸、N，N’-雙丙烯?；?L-胱氨酸和水溶性光引發(fā)劑的混合溶液，用混合溶液浸漬步驟2)得到的凍干的透明質(zhì)酸水凝膠，形成透明體系后實(shí)施光化學(xué)聚合，得到透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。
[0014]所述步驟I)中配制的透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量百分濃度為0.2%?2%，透明質(zhì)酸的分子量為300?100kDa ;配制的胱胺改性的透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量百分濃度為0.2%?2% ；
[0015]所述步驟2)中配制的甲基丙烯酰化透明質(zhì)酸水溶液的質(zhì)量百分濃度為1%?3.
[0016]所述步驟I)中用NaOH溶液和鹽酸調(diào)節(jié)pH值；
[0017]所述步驟I)中的透析是用去離子水透析3天，透析用的透析袋的截留分子量為3.5kDa0
[0018]所述步驟I)和步驟2)中的冷凍干燥是先在零下40°C?零下5°C保持36?96小時(shí)，再在20°C保持4小時(shí)。
[0019]所述的水溶性光引發(fā)劑為2-羥基-4' -(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮、2-氧化戊二酸或1-羥基環(huán)己基苯基丙酮。
[0020]所述步驟2)和步驟3)中的光化學(xué)聚合的時(shí)間為30s?lOmin，光化學(xué)聚合所用的光源的中心波長為365nm、光能量密度為1200mJ/cm2?1500mJ/cm2，光源與樣品的距離為5 ?20cm。
[0021]所述步驟3)中浸漬用的混合溶液的體積等于凍干的透明質(zhì)酸水凝膠的體積，混合溶液中Νε-丙烯?；?L-賴氨酸的濃度為0.2g/mL。
[0022]所述的Νε-丙烯?；?L-賴氨酸的合成方法如下:
[0023]a)將濃度為0.05g/mL?0.5g/mL的L-賴氨酸水溶液置于燒瓶中，向其中加入L-賴氨酸摩爾量0.55?0.75倍的堿式碳酸銅，煮沸2?5小時(shí)后熱過濾，用NaOH溶液調(diào)節(jié)濾液的pH值至9.0 ；
[0024]b)對(duì)步驟a)得到的濾液進(jìn)行冰浴冷卻，然后向其中滴加L-賴氨酸摩爾量1.05?
1.2倍的丙烯酰氯溶液，滴加過程中用NaOH溶液維持pH = 8.0，滴加完成后將溫度升至室溫并維持I?4小時(shí)，然后過濾收集藍(lán)色固體，藍(lán)色固體經(jīng)水洗后再在45°C下真空干燥；
[0025]c)將步驟b)得到的干燥的藍(lán)色固體懸浮于去離子水中，形成濃度為0.05g/mL?5g/mL的懸浮液，將藍(lán)色固體摩爾量2.2?4.0倍的8-羥基喹啉溶于懸浮液體積0.5?1.5倍的氯仿中，得到氯仿溶液，將氯仿溶液加入懸浮液中室溫?cái)嚢?4小時(shí)，過濾后水相用氯仿洗至無色后凍干，得到Νε-丙烯?；?L-賴氨酸。
[0026]所述的N，N’ -雙丙烯?；?L-胱氨酸的合成方法如下:
[0027]Α)將L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成濃度為0.05g/mL?0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其中NaOH與L-胱氨酸的摩爾比為2:1;
[0028]B)對(duì)L-胱氨酸溶液進(jìn)行冰浴冷卻，然后向其中滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，其中丙稀酰氯和L-胱氨酸的摩爾比為(2.1?2.3):1，滴加過程中用NaOH溶液維持pH = 8.0，滴加完成后將溫度升至室溫并維持I?4小時(shí)，再在零下20°C進(jìn)行冷凍干燥；
[0029]C)將步驟B)冷凍干燥得到的物質(zhì)溶于pH = 2的水中，得到質(zhì)量百分濃度為5%?20%的溶液，然后用6?12倍體積量的丙酮沉淀，所得固體經(jīng)真空干燥即得到N，N’ -雙丙稀?；?L-胱氨酸。
[0030]制得的可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有微米級(jí)的多孔結(jié)構(gòu)，其在10%?20%的應(yīng)變范圍內(nèi)的壓縮模量為46.3kPa，在24小時(shí)達(dá)到溶脹平衡，最大溶脹比為12。
[0031]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
[0032]本發(fā)明提供的可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Ne-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法，以甲基丙烯酰化透明質(zhì)酸和Νε-丙烯?；?L-賴氨酸為基本原料，采用兩步光化學(xué)聚合方法制備出可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Nε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。具體的，先用胱胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯依次改性透明質(zhì)酸，得甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸，再經(jīng)光化學(xué)聚合得到透明質(zhì)酸水凝膠；透明質(zhì)酸水凝膠經(jīng)冷凍干燥后浸漬單體Νε-丙烯酰基-L-賴氨酸、交聯(lián)劑N，N’ -雙丙烯?；?L-胱氨酸和水溶性光引發(fā)劑的混合溶液，二次光化學(xué)聚合后得到透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。該雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的形成機(jī)制為光化學(xué)聚合，具有原料經(jīng)濟(jì)性好、條件溫和(室溫進(jìn)行)、反應(yīng)速度快(數(shù)分鐘內(nèi)完成)、反應(yīng)時(shí)間短、工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)。并可通過調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸分子量、交聯(lián)密度、雙網(wǎng)絡(luò)成分含量比例、反應(yīng)濃度等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的力學(xué)性能(如強(qiáng)度、模量)、降解速率和溶脹性能的調(diào)控。另外，該雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備原料為透明質(zhì)酸和賴氨酸衍生物，具有原料易得、生物相容性優(yōu)異的特點(diǎn)，尤其是陽離子型賴氨酸衍生物聚合物成分，可促進(jìn)細(xì)胞粘附和生長。
[0033]本發(fā)明制得的可生物還原的透明質(zhì)酸/聚(Νε-丙烯?；?L-賴氨酸)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠具有相互貫穿的微觀結(jié)構(gòu)及微米級(jí)的多孔結(jié)構(gòu)，該雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠由兩種三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，兼具透明質(zhì)酸三維網(wǎng)絡(luò)的高彈性和高韌性與聚(Ne-丙烯酰基-L-賴氨酸)三維網(wǎng)絡(luò)的高強(qiáng)度和高模量，綜合力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)異。且雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的兩種三維網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)鏈中均含有二硫鍵，可被生物還