培養(yǎng)箱中封閉，2h后用洗滌液 洗滌3次，將單克隆抗體腹水用0. 01mol/l、pH 7. 4的PBS按照原倍、1:10、1:100、1:1000、 1:10000、1:100000、1:1000000稀釋，每孔加100 μ 1，37 °C培養(yǎng)箱中孵育Ih后洗板3次， 加入用0. 〇lmol/L、pH 7. 4的PBS稀釋過的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG酶標(biāo)二抗 (1:10000) 100 μ 1，37°C培養(yǎng)箱中孵育Ih后洗板3次，加入100 μ 1底物溶液，顯色后測定 八45(|值。每個濃度設(shè)置6個重復(fù)，計算得到A均值。
[0065] 3. 1. 2間接酶聯(lián)免疫方法檢測腹水單克隆抗體的效價
[0066] 實驗中，每個樣品設(shè)置一組空白和一組陰性對照：空白對照組在實驗過程中不加 入ΤΤ-05單克隆抗體；陰性對照組用正常小鼠血清代替ΤΤ-05單克隆抗體，其它步驟不變。 每組6個重復(fù)，并計算~ 5(|值平均值。通過計算Ρ/Ν值判斷ΤΤ-05單克隆抗體的特異性。P/ N值=(樣品~5(|值-空白A 45(|值）/陰性A 45(|值，Ρ/Ν值大于2. 1判斷為陽性，反之則判斷 為陰性。實驗結(jié)果說明該單克隆抗體與抗原的免疫反應(yīng)性良好，效價達(dá)到1:100000 (見表 3) 〇
[0067] 表3單克隆抗體腹水效價檢測結(jié)果
[0068]
[0069] 實施例4單克隆抗體特異性檢測
[0070]目前，兒童疫苗研發(fā)的兩個主要趨勢為：為解決一針多效，降低兒童接種負(fù)擔(dān)的 問題，破傷風(fēng)類毒素常與其它疫苗抗原成分共同制備形成聯(lián)合疫苗，如吸附無細(xì)胞百白破 聯(lián)合疫苗等。以及為解決嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，單純的多糖抗原難以激發(fā)機(jī)體產(chǎn) 生足夠的抗體免疫反應(yīng)，而通過多糖與蛋白載體偶聯(lián)解決多糖疫苗不足的多糖蛋白偶聯(lián)疫 苗，如b性流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、流腦AC群腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗等。應(yīng)用本發(fā)明的單克 隆抗體對聯(lián)合疫苗和偶聯(lián)疫苗中會同時存在的其它抗原成分進(jìn)行特異性檢測，從而證明該 單克隆抗體僅特異性地與破傷風(fēng)類毒素反應(yīng)，不與其它非檢測目標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，可用于聯(lián)合 疫苗和偶聯(lián)疫苗中破傷風(fēng)類毒素的定性測定。
[0071] 本實施例中白喉類毒素、百日咳原液、b型流感嗜血桿菌莢膜多糖、A群流腦多糖、 C群流腦多糖按照中華人民共和國藥典2010版三部制備獲得。吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫 苗、b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、AC群腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)疫苗可按照中華人民共和國藥 典2010版三部制備獲得或購買市售苗獲得。
[0072] 4. 1實驗方法
[0073] 實驗使用間接酶聯(lián)免疫進(jìn)行檢測，每個樣品設(shè)置一組空白和一組陰性對照：空白 對照組在實驗過程中不加入TT-05單克隆抗體；陰性對照組用正常小鼠血清代替TT-05單 克隆抗體，按照3. 1.1進(jìn)行操作。每組6個重復(fù)，計算~5(|值平均值。再通過計算OD值判 斷TT-05單克隆抗體的特異性。P/N值=(樣品A 45c^ -空白A 45。值）/陰性A 45Q值，P/N值 大于2. 1判斷為陽性，反之則判斷為陰性。
[0074] 4. 2間接酶聯(lián)免疫操作步驟
[0075] 將濃度為0. 5 μ g/ml的破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳原液、b型流感嗜血桿 菌莢膜多糖、b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、A群流腦多糖、C群流腦多糖及10倍稀釋的AC群 腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)疫苗和10倍稀釋的經(jīng)處理的吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗原液（按照 中國藥典三部2010版中制備），100 μ 1/孔包被酶標(biāo)板，4°C過夜。次日以洗滌液洗滌3次， 用1% (體積比）的牛血清白蛋白37°C培養(yǎng)箱中封閉，2h后用洗滌液洗滌3次，將TT-05單 克隆抗體用0. 01mol/L、pH 7. 4的PBS按照I :1000稀釋，取100μ1，6個重復(fù)，37°C培養(yǎng)箱 中孵育Ih后洗板3次，加入用0. 01mol/L、pH 7. 4的PBS稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊 抗鼠 IgG酶標(biāo)二抗（1:10000) 100 μ 1，37°C培養(yǎng)箱中孵育Ih后洗板3次，加入100 μ 1底物 溶液，顯色后測定~5(|值。同一樣品的6個重復(fù)孔的A45tl值計算平均值。所述洗滌液與實施 例1中1. 4. 3間接酶聯(lián)免疫操作所述洗滌液相同。
[0076] 4. 3實驗結(jié)果
[0077] 間接酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果（見表4)說明，該單克隆抗體與白喉類毒素、百日咳原液、 b型流感嗜血桿菌莢膜多糖、A群流腦莢膜多糖、C群流腦莢膜多糖不發(fā)生交叉反應(yīng)，能夠特 異性識別破傷風(fēng)類毒素。
[0078] 表4本發(fā)明單克隆抗體特異性檢測結(jié)果
[0079]
[0080] 實施例5本發(fā)明單克隆抗體在吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗和以破傷風(fēng)類毒素 (TT)為蛋白載體的偶聯(lián)疫苗中破傷風(fēng)類毒素檢測時的應(yīng)用
[0081] 吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗和以破傷風(fēng)類毒素為載體的偶聯(lián)疫苗在研發(fā)和生產(chǎn) 過程中需要檢測破傷風(fēng)類毒素載體蛋白（TT)的含量，而吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗中還 含有白喉類毒素和百日咳原液，偶聯(lián)疫苗中還含有其它抗原成分如莢膜多糖等，本發(fā)明應(yīng) 用TT-05單克隆抗體對吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗和以TT為載體的偶聯(lián)疫苗進(jìn)行定量檢 測，能特異的與破傷風(fēng)類毒素發(fā)生反應(yīng)，而不與疫苗中百日咳原液和白喉原液以及疫苗中 的其它抗原組分發(fā)生反應(yīng)，可檢測吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗和偶聯(lián)疫苗中破傷風(fēng)類毒素 的濃度，檢測靈敏度達(dá)到納克（ng)級。本實施例中白喉類毒素、百日咳原液、b型流感嗜血 桿菌莢膜多糖、A群流腦多糖、C群流腦多糖按照中華人民共和國藥典2010版三部制備獲 得。吸附無細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗、b型流感嗜血桿菌偶聯(lián)疫苗、AC群腦膜炎球菌多糖偶聯(lián)疫 苗可按照中華人民共和國藥典2010版三部制備獲得或購買市售苗獲得。
[0082] 5. 1封閉酶聯(lián)免疫檢測定量檢測方法的建立
[0083] 5. I. 1抗原包被濃度和競爭抗體濃度的確定
[0084] 采用方正滴定法確定抗原最適包被濃度和單克隆抗體最適稀釋度?？乖粷舛?的篩選：用pH 9. 6包被液將TT標(biāo)準(zhǔn)品按照2 μ g/ml、1 μ g/ml、0. 5 μ g/ml、0. 25 μ g/ml的 濃度作4個稀釋度，組成方陣，100 μ I/孔包被酶標(biāo)板。將單克隆抗體腹水和陰性腹水按照 1:250、1 : 500、1 : 1000、1 : 2000、1:4000設(shè)置5個稀釋度，每孔按照常規(guī)間接酶聯(lián)免疫 方法操作，以確定最佳的抗原包被量和一抗最適濃度。
[0085] 5. L 2操作步驟
[0086] 將抗原用0. 05mol/L pH 9. 6包被液按表5濃度梯度進(jìn)行稀釋，以每孔100 μ 1/孔 加入酶標(biāo)板，37°C孵育2h ;用洗滌液洗板，重復(fù)3次，加入1% (體積比）的小牛血清白蛋 白（BSA)于37°C封閉Ih后用洗滌液洗滌，重復(fù)3次；加入不同稀釋濃度的單克隆抗體和陰 性對照，100 μ 1/孔，37°C孵育Ih ;洗滌3次，加入1 : 10000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊 抗鼠 IgG酶標(biāo)二抗50 μ 1，37°C在培養(yǎng)箱中孵育Ih ;用洗滌液洗滌3次，每孔加入底物溶液 100 μ I，置室溫暗處顯色lOrnin，顯色后每孔加入2M的H2SO4終止液100 μ I，于波長450 _比 色測定~5(|值。所述洗滌液與實施例1中1. 4. 3間接酶聯(lián)免疫操作所述洗滌液相同。
[0087] 比較單克隆抗體腹水和陰性腹水的^5(|值，選擇它們A比值最大時的包被抗原的 最大稀釋度為抗原包被最佳濃度，對應(yīng)的腹水稀釋度為最佳稀釋度。根據(jù)最終檢測結(jié)果 確定封閉酶聯(lián)免疫方法中抗原最佳包被濃度為〇. 5 μ g/ml，單克隆抗體的最佳稀釋度為 I ： 1000 o
[0088] 5. 1. 3封閉酶聯(lián)免疫檢測定量檢測方法的建立
[0089] 用包被液將TT標(biāo)準(zhǔn)品（購自中