三種沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及三種沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及其檢 測方法和檢測試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 沃爾巴克氏體（Wolbachia)是廣泛分布于節(jié)肢動物體內的共生微生物，它可能是 昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗 翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩(wěn)定地存在于 宿主的生殖細胞內，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質不親和、雌性 化和殺雄性等調控宿主的生殖活動。通過這些調控作用促進其在宿主種群內廣泛傳播。
[0003] 在沃爾巴克氏體（Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質不親和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常見的一種類型。它表現(xiàn)為當被沃爾巴克氏 體（Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精 子和卵子結合后胚胎無法發(fā)育。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的胞質不親和的特性可導致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替 代。它的應用對蚊媒病防治具有巨大的價值。近期研宄發(fā)現(xiàn)，沃爾巴克氏體（Wolbachia) 不僅具有上述的特性外，同時它還能在蚊子體內與蚊子攜帶的一些重要的病原生物（如 登革病毒，瘧原蟲等）相互作用，抑制它們在蚊子體內的增值和擴散從而在阻斷這些病原 生物傳播于人類。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內組織的分 布相關，所以，了解沃爾巴克氏體（Wolbachia)在蚊子體內組織分布有助于快速篩選出傳 播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監(jiān)測沃爾巴克氏體 (Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時也有利于高效率地監(jiān)測大規(guī)模大地域范圍的沃爾 巴克氏體（Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。
[0004] 在自然界中，蚊子的種類有很多，常見的有伊蚊和庫蚊兩種。伊蚊分為白紋伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不攜帶沃爾巴克氏體。由于沃爾巴克氏菌只能存活于宿主體內，不 能在體外自由生活，因而如何有效特異地檢測沃爾巴克氏菌是對該細菌研宄的必備工具。 比較常用的檢測手段有聚合酶鏈反應法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗時耗力，而 且特異性不好。隨著PCR方法的普及，針對沃爾巴克氏體的檢測有了很大的進步。不同蚊 種攜帶不同的沃爾巴克氏體，通過PCR結果能夠直觀的看出蚊子攜帶的不同沃爾巴克氏體 類型，這樣為我們的日常檢測提供了很大的便利。目前針對不同沃爾巴克氏體PCR檢測的 方法還不完善。

【發(fā)明內容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種專一性強、特異性高和靈敏度高的伊蚊A型、伊蚊B型和 庫蚊沃爾巴克氏體等三種沃爾巴克氏體的熒光檢測引物。
[0006] 本發(fā)明的三種沃爾巴克氏體的熒光檢測引物，其特征在于，包括
[0007] (1)針對伊蚊A型沃爾巴克氏體：
[0008] wAlbAF :5' -CAGGGTTGATGTTGAAGGAG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示）；
[0009] wAlbAR :5' -GCACCAGCTTTTACTTGACC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0010] 探針 A :5' -TATCTTCAATTGCTATATCGTAATAAACG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0011] 探針A兩端分別結合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl ;
[0012] (2)針對伊蚊B型沃爾巴克氏體：
[0013] wAlbBF :5' -AAAGGAACCGAAGTTCATGAT-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）；
[0014] wAlbBR :5' -TTGTTTAGTTGTGAGTAAAGTCCC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所 示）；
[0015] 探針 B :5' -CAACATTTGCTCCAACAACTGTTGC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6 所 示）；
[0016] 探針B兩端分別結合有熒光發(fā)生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl ;
[0017] (3)針對庫蚊沃爾巴克氏體：
[0018] wPipF:5' -GTTTGTGCAGCTAATAG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示）；
[0019] wPipR:5' -GTCTGCAAGGCCTATTTCTACTG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 8 所示）；
[0020] 探針 C :5' -CTTTCAATTGAAAAGATTCGATCAAC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 9 所 示）；
[0021] 探針C兩端分別結合有熒光發(fā)生基團Texas Red和熒光淬滅基團BHQ2。
[0022] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的三種沃爾巴克氏體 的檢測方法，其特征在于，提取樣品DNA，以該樣品DNA為模板，以上述三種沃爾巴克氏體的 熒光檢測引物wAlbAF、wAlbAR、探針 熒光定量PCR擴增，擴增反應完成后，根據(jù)探針標記的熒光發(fā)生基團的熒光信號，讀取并記 錄樣品的PCR循環(huán)次數(shù)Ct，根據(jù)樣品的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品是否含有伊蚊 A型、伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體。
[0023] 所述的進行熒光定量PCR擴增，其反應條件優(yōu)選為：預變性50°C 5分鐘，95°C 15 分鐘；擴增94°C 15秒、55°C 45秒，40個循環(huán)；55°C的時候收集焚光信號。
[0024] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種三種沃爾巴克氏體的檢測試劑盒，包括熒光檢測 引物和PCR試劑，其特征在于，所述的熒光檢測引物包括：
[0025] (1)針對伊蚊A型沃爾巴克氏體：
[0026] wAlbAF :5' -CAGGGTTGATGTTGAAGGAG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示）；
[0027] wAlbAR :5' -GCACCAGCTTTTACTTGACC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0028] 探針 A :5' -TATCTTCAATTGCTATATCGTAATAAACG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所示）；
[0029] 探針A兩端分別結合有熒光發(fā)生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl ;
[0030] (2)針對伊蚊B型沃爾巴克氏體：
[0031] wAlbBF :5' -AAAGGAACCGAAGTTCATGAT-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4 所示）；
[0032] wAlbBR :5' -TTGTTTAGTTGTGAGTAAAGTCCC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所 示）；
[0033] 探針 B :5' -CAACATTTGCTCCAACAACTGTTGC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6 所 示）；
[0034] 探針B兩端分別結合有熒光發(fā)生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl ;
[0035] (3)針對庫蚊沃爾巴克氏體：
[0036] wPipF:5' -GTTTGTGCAGCTAATAG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 7 所示）；
[0037] wPipR:5' -GTCTGCAAGGCCTATTTCTACTG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 8 所示）；
[0038] 探針 C :5' -CTTTCAATTGAAAAGATTCGATCAAC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 9 所 示）；
[0039] 探針C兩端分別結合有熒光發(fā)生基團Texas Red和熒光淬滅基團BHQ2。
[0040] 利用本發(fā)明的熒光檢測引物按照本發(fā)明的檢測方法能夠快速高效專一的檢測出 伊蚊A型、伊蚊B型和庫蚊沃爾巴克氏體，具有專一性強，特異性高（伊蚊只檢測出伊蚊沃 爾巴克氏體，而庫蚊只檢測出庫蚊沃爾巴克氏體），靈敏度高，其最低檢測限為lOOcopies/ ml 〇
[0041] 因此，本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便等優(yōu)點。
【附圖說明】：
[0042] 圖1是伊蚊A型沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結果圖，其中I、II、III、IV分別代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0043] 圖2是伊蚊B型沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結果圖，其中I、II、III、IV分別代表 DNA抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0044] 圖3是庫蚊沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結果圖，其中I、II、III、IV分別代表DNA 抽提液，10、100、1000倍稀釋的DNA抽提液；
[0045] 圖4是伊蚊和庫蚊沃爾巴克氏體的重復性的實驗結果圖，其中I、11分別代表不 同的樣品的擴增曲線；
[0046] 圖5是FAM檢測通道對伊蚊A型沃爾巴克氏體的特異性的實驗結果圖；
[0047] 圖6是FAM檢測通道對伊蚊B型和wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體） 的特異性的實驗結果圖；
[0048] 圖7是HEX檢測通道對伊蚊B型沃爾巴克氏體的特異性的實驗結果圖；
[0049] 圖8是HEX檢測通道對伊蚊A型和wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體） 的特異性的實驗結果圖；
[0050] 圖9是Texas Red檢測通道對wPip型沃爾巴克氏體（庫蚊沃爾巴克氏體）的特 異性的實驗結果圖；
[0051] 圖10是Texas