泳設(shè)備有限公司；
[0038] 凝膠成像系統(tǒng)JY04S-3C，生產(chǎn)廠家為北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；
[0039] PCR儀：Life Express，生產(chǎn)廠家為博日科技有限公司。
[0040] 實(shí)施例1菌株的分離純化
[0041] 所述黑茶的優(yōu)勢"金花"菌的分離純化步驟具體如下：
[0042] ( 1)選取茶樣
[0043] 選取湖南安化茶廠"丨'丨7十:木倉? "木質(zhì)倉庫中茶葉中不同年份的茯磚茶產(chǎn)品以 及湖南益陽市生產(chǎn)、市售主流茯磚茶產(chǎn)品，作為原始菌株分離的材料。上述所選取產(chǎn)品的 茶樣滿足GH/T1070對茶葉包裝的規(guī)定，滿足GH/T1071對茶葉貯存的規(guī)定，滿足GB2762- 2012對食品中污染物的限量，滿足GB2763/GB26130中對農(nóng)藥最大殘留的限量，滿足GB/ T9833. 2- 2013對《緊壓茶》部分的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；同時，選取的茶樣滿足：包裝無破損、無 污漬；茶葉外形平整、茶磚內(nèi)部發(fā)花均勻；選取的同批次產(chǎn)品，"金花"生長茂盛、內(nèi)部生長均 勻；
[0044] (2)對所選取的茶樣進(jìn)行編號
[0045] 對湖南安化茶廠"丨:』汁:.木·企》"木質(zhì)倉庫不同年份的產(chǎn)品分別編號為I、11、111、 IV、V，上述編號依次對應(yīng)1985年、1997年、2002年、2010年、2013年生產(chǎn)的茶樣產(chǎn)品；對選 取的市售主流茯磚茶產(chǎn)品編號為A、B、C、D、E ;
[0046] (3)預(yù)處理茶樣
[0047] 茶樣收集后，在無菌條件下，選取"金花"生長茂盛、內(nèi)部生長均勻的茶樣I，取所 述中心帶菌的茶樣25g，粉碎，過80-100目篩，然后將過篩的茶粉全部轉(zhuǎn)移至225mL的無菌 水中，充分震蕩混合；
[0048] ( 4 )涂布培養(yǎng)含菌茶樣液體
[0049] 取無菌水將上述步驟獲得的混合液進(jìn)行梯度稀釋，取ImL稀釋梯度為106的含菌 液體涂布于PDA固體平板培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0050] (5 )培養(yǎng)并記錄菌落生長情況
[0051] 將涂布后的PDA固體平板培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 28-3(TC，培養(yǎng)7天，在培養(yǎng)過程中，按照冠突散囊菌Eurotium cristatum的形態(tài)學(xué)、生理生 化特征對所述菌落的形態(tài)特征進(jìn)行菌落的識別并編號，每12h量取菌落的直徑并記錄；
[0052] (6)挑取純化單菌落
[0053] 取上述步驟中生長最快的5株菌的單菌落，挑取菌落并劃線接種至所述PDA培養(yǎng) 基上，于28_30°C條件下培養(yǎng)7天，每個菌落挑取三個樣品進(jìn)行純化，傳代培養(yǎng)的次數(shù)為兩 次，最終選取純化培養(yǎng)過程中菌落直徑增長最快的5株菌株進(jìn)行保存；
[0054] (7)保存原始菌株
[0055] 按照常規(guī)方法制備PDA試管斜面，挑取上述選用的5株菌分別劃線接種至所述PDA 試管斜面上，于28-30°C條件下，培養(yǎng)7天后，將試管封存后冷凍備份。
[0056] 同樣的，所述茶樣II、III、IV、V、A、B、C、D、E的菌種分離純化參照上述實(shí)驗(yàn)操作， 得到多株備選育樣品。
[0057] 結(jié)果顯示，選育的菌株其菌落平均直徑生長的速度超過5mm/d。
[0058] 其中，不規(guī)則菌落直徑的折算參考文獻(xiàn)SerraJ. Image analysis and mathematical morphology[M]· Academic Press, Inc. ,1983.有關(guān)圖像處理以及直徑折算 內(nèi)容所述方法。
[0059] 實(shí)施例2菌株的選育
[0060] 選育步驟a.按照發(fā)酵時茶葉中含菌特性以及金花生長程度選育菌株茶葉中"金 花"的生長程度選育菌株
[0061] 選育思路：在相同的培養(yǎng)條件下，選用來源于同一產(chǎn)地的同一批次的黑毛茶原料 進(jìn)行菌株接種的發(fā)酵試驗(yàn)。如果該菌株可以滿足茶葉品質(zhì)對發(fā)酵菌所具有的菌種特性以及 "金花"生長程度對菌株的要求，則接種該菌株以后，則在茶產(chǎn)品中該菌株能夠快速生長，且 在一定時間內(nèi)其發(fā)酵茶葉中能夠達(dá)到一定的含菌數(shù)量，從而成長成為優(yōu)勢菌，抑制雜菌的 生長；并且其良好的特性體現(xiàn)為最終茶葉外觀以及品質(zhì)。否則，認(rèn)為接種該菌株不能滿足茶 葉對發(fā)酵菌的要求，即發(fā)酵過程接種使用該菌株對比不能在相同的發(fā)酵條件下迅速成長為 優(yōu)勢菌株，達(dá)不到相應(yīng)菌含量，產(chǎn)品最終的外觀與品質(zhì)得不到保證，或者其在茶葉中的生長 周期過長，甚至燒心，霉變。
[0062] 所述黑茶的優(yōu)勢"金花"菌的選育步驟具體如下：
[0063] 1)分別取茶樣I、II、III、IV、V、A、B、C、D、E經(jīng)過上述步驟分離純化的備份菌株 接種至茄形瓶的PDA固體培養(yǎng)基上，于28°C條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)15天以后用IOOmL無菌水沖 洗上述固體培養(yǎng)基，然后將沖洗后獲得的含有菌體的混合液經(jīng)無菌紗布過濾獲得孢子懸浮 液，編號待用；
[0064] 2)選用原產(chǎn)地為湖南安化縣的一芽三葉或者一芽四葉的黑毛茶，篩分獲得三級 (特茯）黑毛茶原料350kg，其中茶梗按重量計(jì)占全部茶葉的15-20%，上述黑毛茶采用高溫 汽蒸，蒸汽壓力為〇. 3-0. 6Mpa，溫度為105-115°C，時間為8-20s，將汽蒸后的黑毛茶進(jìn)行渥 堆，渥堆高度為40-60cm，優(yōu)選40-50厘米，渥堆空氣相對濕度80%以上，渥堆時間為4-12h， 渥堆完成后，控制茶葉水含量為15%-25%，優(yōu)選18%-22%，將渥堆后的黑茶進(jìn)行二次汽蒸，汽 蒸條件為98-102°C，汽蒸壓力為0.6-0. 5MPa，汽蒸時間小于10秒，控制所述黑茶的磚坯 含水量為20-25%，汽蒸后，向所述黑茶中均勻混入上述步驟制備的孢子懸浮液Ι-lOmL，然 后按照每塊茯磚含有上述得到的混合后的原料Ikg的規(guī)格進(jìn)行人工配料壓磚，于40-70°C 壓磚，40°C退磚，然后轉(zhuǎn)入烘房，所述烘房在培育期、發(fā)花期濕度控制不大于70%，溫度為 27-29°C ;在發(fā)花進(jìn)行第五天的時候，用特制的取樣刀具，取用茶磚中心內(nèi)部的茶樣25g，并 按照GB4789. 2-94菌落總數(shù)測定所述方法計(jì)算"金花"菌以及雜菌的菌落總數(shù)，取樣完畢以 后，所述茶葉繼續(xù)在烘房發(fā)花，發(fā)花十天以后，將烘房緩慢升溫，直至黑茶產(chǎn)品中的水分低 于14%，產(chǎn)品出烘房，然后按照GB4789. 2-94菌落總數(shù)測定所述的方法進(jìn)行"金花"菌菌落 總數(shù)含量的檢測，分析統(tǒng)計(jì)發(fā)花結(jié)束產(chǎn)品中金花菌菌落總數(shù)產(chǎn)品相關(guān)理化指標(biāo)的檢測參見 GB2762- 2012、GB2763/GB26130、GB/T9833. 2- 2013 ;
[0065] 其中，每份菌株接種3個黑茶樣品，并按照上述黑茶發(fā)花加工方法制作不接種所 述分離的菌株的茯磚茶作為實(shí)驗(yàn)的對照組；
[0066] 3)直接挑取上述步驟獲得的茶葉內(nèi)部的符合選育條件的"金花"菌于PDA固體平 板培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，符合選育條件的菌種至少取樣一份，純化培養(yǎng)后的菌株編號為A系 列，于PDA試管斜面凍藏，備份，其檢測的結(jié)果(部分）列出選用的菌株，編號為A，結(jié)果見表 1,
[0067] 表1菌種與茶葉發(fā)酵選育結(jié)果表(部分）
[0068]
[0069]
[0070] 經(jīng)過本步驟選育得到的菌株共計(jì)31株，在進(jìn)行黑茶發(fā)花時，發(fā)花迅速，可以在發(fā) 花第五天使得茶樣中"金花"菌菌落總數(shù)能夠達(dá)到5X 104CFU/g絕干茶葉，雜菌含量小于 I X 102CFU/g絕干茶葉；且發(fā)花結(jié)束，"金花"菌菌落總數(shù)能夠達(dá)到4X 106CFU/g絕干茶葉水 平；產(chǎn)品成品率達(dá)到99% ;發(fā)酵茶產(chǎn)品外表"金花"生長茂盛、內(nèi)部生長均勻、口感良好；發(fā)酵 茶產(chǎn)品符合質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)的菌株。
[0071] 選育步驟b.采用高溫發(fā)酵選育耐高溫菌株
[0072] 選育思路：該耐高溫實(shí)驗(yàn)選育得到的菌株能夠使得發(fā)酵能夠在較高溫度下進(jìn)行， 即在茶產(chǎn)品發(fā)酵中在較高溫度下，保持選育步驟a中菌株發(fā)酵茶葉能達(dá)到的效果，滿足實(shí) 際生產(chǎn)中溫度季節(jié)性的變化，在夏季氣溫較高的條件下進(jìn)行發(fā)花生產(chǎn)。
[0073] 首先，在PDA培養(yǎng)基中對菌種進(jìn)行分離純化，重復(fù)挑取單菌落傳代培養(yǎng)10代以上，選 擇能夠在38°C條件下穩(wěn)定傳代生長的菌株，優(yōu)選菌落直徑增長速度快的菌株；然后，選取該 批菌株重復(fù)步驟a -代，并將其發(fā)酵溫度設(shè)置在30-34°C之間，按照步驟a的選育標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌 種的選育，從茶葉中分離純化得到其中生長的優(yōu)勢菌株B，保存，編號進(jìn)行下一步選育實(shí)驗(yàn)。
[0074] 所述黑茶的優(yōu)勢"金花"菌的選育步驟具體如下：
[0075] 1)按照前述常規(guī)方法制作PDA固體平板培養(yǎng)基，挑取編號為A的原始菌株菌落劃 線接種至所述PDA固體平板培養(yǎng)基，然后將所述平板置于38°C的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)7天后，挑取能夠生長的菌株單菌落，重復(fù)上述步驟10代以上，選取能夠在所述38°C溫 度下生長的菌落，對選取的菌株編號B，用PDA試管斜面凍存?zhèn)浞荩?br>[0076] 2)將上述選取的菌株重復(fù)上述步驟a中的黑茶發(fā)花發(fā)酵步驟，區(qū)別僅是將所述發(fā) 花步驟中的烘房溫度改變?yōu)?0_34°C，然后在發(fā)花進(jìn)行第五天，用特制的取樣刀具取用制備 的茶磚中心內(nèi)部的茶樣25g進(jìn)行檢測；
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