一種保藏酵母菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種保藏酵母菌的方法，屬于酵母菌的保藏技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母為單細(xì)胞真菌，是子囊菌、擔(dān)子菌等幾科單細(xì)胞真菌的通稱。酵母無(wú)害，容易 生長(zhǎng)，可將大分子物質(zhì)分解成細(xì)胞新陳代謝易于利用的小分子物質(zhì)，屬于異養(yǎng)生物。酵母菌 是人類文明史中被應(yīng)用得最早的微生物，其既可用于釀造生產(chǎn)，又是遺傳工程和細(xì)胞周期 研宄的模式生物，受到廣大科研工作者的青睞。
[0003] 釀酒酵母在分子遺傳學(xué)方面被人們的認(rèn)識(shí)最早，也是最先作為外源基因表達(dá)的酵 母宿主，畢赤酵母作為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展迅速，應(yīng)用也最為廣泛，此外， 漢遜酵母中較高的目的蛋白表達(dá)量使得其也日益應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)中。隨著大量新型酵 母工程菌株的構(gòu)建，酵母工程菌的培養(yǎng)與保存成為了影響其蛋白表達(dá)的重要因素：菌種保 存方法得當(dāng)，復(fù)蘇后酵母生長(zhǎng)狀態(tài)良好，目的蛋白表達(dá)量高，產(chǎn)量大大提高。傳統(tǒng)的酵母菌 保藏方法主要有兩種，一，酵母菌保存于含有一定比例甘油的培養(yǎng)基中，于低溫或液氮中保 存；二，將酵母中加入脫脂奶粉等保護(hù)劑，進(jìn)行凍干保存。傳統(tǒng)的方法，可以使得酵母成功地 復(fù)蘇培養(yǎng)，逐級(jí)放大生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)與收獲。然而，傳統(tǒng)的保藏方式會(huì)造成酵母 菌的大量死亡，尤其隨著保存時(shí)間的增加，酵母的活菌率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，影響了復(fù)蘇 后的酵母擴(kuò)大培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高酵母菌復(fù)蘇時(shí)活菌率的保藏酵母菌的方法、利用 該方法保藏的酵母工程菌的目的蛋白表達(dá)量也能夠獲得顯著提高。
[0005] 本發(fā)明提供的一種保藏酵母菌的方法，是在酵母菌液中加入甘油和瓊脂，混勻后 迅速置于液氮中冷凍，之后于-20°c以下長(zhǎng)期保藏。
[0006] 其中，酵母菌液中甘油的終濃度為12% -18%，瓊脂的終濃度為0. 02% -0. 1%，所 述％為質(zhì)量百分比。
[0007] 優(yōu)選地，酵母菌液中甘油的終濃度為14 % -16 %，瓊脂的終濃度為 0. 03% -0. 07%，所述％為質(zhì)量百分比。
[0008] 更優(yōu)選地，酵母菌液中甘油的終濃度為15%，瓊脂的終濃度為0.05%，所述％為 質(zhì)量百分比。
[0009] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明提供的上述方法可以針對(duì)任何濃度的酵母菌液 進(jìn)行冷凍保藏，為了節(jié)省成本、提高酵母菌保藏效率，優(yōu)選地酵母菌液中酵母菌的〇D_為 13-22,再優(yōu)選地，為15-17,更優(yōu)選地為19-21。
[0010] 本發(fā)明所述酵母菌為酵母工程菌或天然酵母菌，例如釀酒酵母、畢赤酵母、漢遜酵 母等。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，記載了保藏酵母菌的具體方法為：
[0012] (1)將通過(guò)鑒定的釀酒酵母、畢赤酵母及漢遜酵母工程菌株劃線接種到Y(jié)ro瓊 脂固體培養(yǎng)基上，30-37°C培養(yǎng)24-72小時(shí)后，挑取單菌落，接種于YH)液體培養(yǎng)基中， 30-37°C，振動(dòng)培養(yǎng)18-36小時(shí)；經(jīng)分光光度法測(cè)定，酵母菌的OD_值為15. 4-16. 2 ;
[0013] (2)將培養(yǎng)的菌液按照1% -10%的接種量轉(zhuǎn)接至新的YH)液體培養(yǎng)基中，30_37°C 繼續(xù)振動(dòng)培養(yǎng)18-36小時(shí)；經(jīng)分光光度法測(cè)定，酵母菌的OD_值為19. 3-20. 2 ;
[0014] (3)收獲不同類型的酵母菌液，加入甘油至終濃度為15%，加入瓊脂至終濃度為 0. 05%，混勻后迅速置于液氮中冷凍，后放于-20°C以下長(zhǎng)期保存。
[0015] 本發(fā)明提供一種酵母菌保藏液，其含有甘油和瓊脂。
[0016] 進(jìn)一步地，該酵母菌保藏液中，甘油的終濃度為12% -18%，瓊脂的終濃度為 0. 02% -0. 1%，所述％為質(zhì)量百分比。
[0017] 優(yōu)選地，該酵母菌保藏液中，甘油的終濃度為14% -16%，瓊脂的終濃度為 0. 03% -0. 07%，所述％為質(zhì)量百分比。
[0018] 更優(yōu)選地，該酵母菌保藏液中，甘油的終濃度為15 %，瓊脂的終濃度為0. 05 %，所 述％為質(zhì)量百分比。
[0019] 本發(fā)明提供了上述酵母保藏液在冷凍保藏酵母菌中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明提供了瓊脂在保藏酵母菌中的應(yīng)用，具體為酵母菌液中瓊脂的終濃度為 0.02% -0. 1%，優(yōu)選0.03% -0.07% ;所述％為質(zhì)量百分比。
[0021] 本發(fā)明提供的瓊脂在保藏酵母菌中的應(yīng)用，更優(yōu)選為酵母菌液中瓊脂的終濃度為 0. 05%，所述％為質(zhì)量百分比。
[0022] 本發(fā)明的保藏酵母菌的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0023] (1)操作簡(jiǎn)便，成本低。
[0024] (2)通過(guò)在保藏體系中加入低濃度的液態(tài)瓊脂和甘油，使二者共同形成保護(hù)體系， 減少凍融過(guò)程中溫度變化對(duì)細(xì)菌的傷害，改善了酵母菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，大大提高酵母菌在不 同保存溫度下的存活率以及酵母菌復(fù)蘇時(shí)的活菌率。
[0025] (3)由于酵母菌的存活率大大提高，因此，利用基因工程酵母表達(dá)的蛋白量大大增 加，提高了目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。
[0026] (4)本發(fā)明方法適用范圍較廣，在不同程度的低溫條件下均可實(shí)現(xiàn)對(duì)酵母菌種的 保護(hù)，且保藏期長(zhǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0028] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段； 實(shí)施例中所用的試劑為市售商品。實(shí)施例中所用的釀酒酵母、畢赤酵母及漢遜酵母工程菌 株均為北京科興生物制品有限公司根據(jù)常規(guī)分子生物學(xué)方法構(gòu)建得到的含有目的基因的 酵母工程菌株。
[0029] 實(shí)施例1保藏酵母菌的方法
[0030] 1、將通過(guò)鑒定的釀酒酵母、畢赤酵母及漢遜酵母工程菌株劃線接種到Y(jié)ro瓊脂固 體培養(yǎng)基上，33 °C培養(yǎng)48小時(shí)后，挑取單菌落，接種于ΥΗ)液體培養(yǎng)基中，33 °C，振動(dòng)培養(yǎng)24 小時(shí)，分光光度法測(cè)定酵母菌的密度：
[0031] 表 1
[0032]
[0033] 2、步驟1培養(yǎng)的菌液5ml轉(zhuǎn)接至新的YH)液體培養(yǎng)基95ml中（接種體積比例 5% )，于33°C下繼續(xù)振動(dòng)培養(yǎng)24小時(shí)，分光光度法測(cè)定酵母菌的密度：
[0034] 表 2
[0035]
[0036] 3、取步驟2獲得的釀酒酵母、畢赤酵母及漢遜酵母工程菌液各Iml X 2份（三種酵 母菌共6份），分別加入滅菌甘油至終濃度為15% (質(zhì)量百分比），加入滅菌瓊脂至終濃度 為0. 05% (質(zhì)量百分比），混勻后迅速置于液氮中冷凍，后分別置于-20°C及_70°C中保存。 與此同時(shí)，取釀酒酵母、畢赤酵母及漢遜酵母工程菌液各lmlX2份，按照傳統(tǒng)的菌種保藏 方法，分別加入滅菌甘油至終濃度為15%，后分別置于-20°C及_70°C中保存。
[0037] 實(shí)施例2不同保藏時(shí)間活菌率比較
[0038] 實(shí)施例1中的各酵母菌保存3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、12個(gè)月后，取出，檢測(cè)其活菌率 (%)，結(jié)果如下：
[0039] 表3 3個(gè)月活菌率檢測(cè)率（％ )
[0040]
[0041] 表4 6個(gè)月活菌率檢測(cè)率（％ )
[0042]
[0043] 表5 9個(gè)月活菌率檢測(cè)率（％ )
[0044]
[0045] 表6 12個(gè)月活菌率檢測(cè)率（％ )
[0046]
[0047] 上述結(jié)果表明，在加入低濃度的液態(tài)瓊脂后，酵母菌種在-20°C和-70°C溫度下、 不同保藏時(shí)間的存活率都較不加瓊脂的存活率有顯著提高。
[0048] 實(shí)施例3本發(fā)明保藏酵母菌的方法對(duì)酵母菌蛋白表達(dá)量的影響
[0049] 在釀酒酵母，畢赤酵母及漢遜酵母菌種的不同保存時(shí)間，分別取不加瓊脂（傳統(tǒng) 方法）及加入瓊脂（本發(fā)明實(shí)施例1的方法）的菌種，按照實(shí)施例1的方法培養(yǎng)，在培養(yǎng) 24小時(shí)后，均加入相同劑量的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)目的抗原。誘導(dǎo)表達(dá)72小時(shí)后，通過(guò)采 用ELISA的方法，分別測(cè)定釀酒酵母，畢赤酵母及漢遜酵母的抗原表達(dá)量，并計(jì)算其抗原表 達(dá)率（％)，見(jiàn)表7。表中的"不加"指?jìng)鹘y(tǒng)方法僅添加甘油至終濃度為15%于液氮中保藏 酵母菌，"加入"指本發(fā)明實(shí)施例1的方法保藏的酵母菌。
[0050] 表7本發(fā)明保藏方法的不同酵母菌其蛋白表達(dá)率（％ )
[0051]
[0052] 上述結(jié)果表明，加入液體瓊脂之后，目的抗原的表達(dá)率增加，由此可見(jiàn)，該方法的 應(yīng)用可提高目的蛋白的表達(dá)率，增加目的抗原的產(chǎn)量。
[0053] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種保藏酵母菌的方法，其特征在于，在酵母菌液中加入甘油和瓊脂，混勻后迅速置 于液氮中冷凍，之后于-20°C以下長(zhǎng)期保藏。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中甘油的終濃度為12% -18%， 瓊脂的終濃度為0.02% -0. 1%，所述％為質(zhì)量百分比。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中甘油的終濃度為14% -16%， 瓊脂的終濃度為0. 03% -0. 07 %，所述％為質(zhì)量百分比。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中甘油的終濃度為15%，瓊脂的 終濃度為〇. 05 %，所述％為質(zhì)量百分比。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酵母菌液中酵母菌的OD_為13-22。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌為酵母工程菌或天然酵母菌。7. -種酵母菌保藏液，其特征在于，含有甘油和瓊脂。8. 權(quán)利要求7所述的酵母保藏液在冷凍保藏酵母菌中的應(yīng)用。9. 瓊脂在保藏酵母菌中的應(yīng)用，其特征在于，酵母菌液中瓊脂的終濃度為 0. 02% -0. 1%，所述％為質(zhì)量百分比。10. 瓊脂在保藏酵母菌中的應(yīng)用，其特征在于，酵母菌液中瓊脂的終濃度為0. 05%，所 述％為質(zhì)量百分比。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種保藏酵母菌的方法，屬于菌種保藏技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)在酵母菌液中添加甘油和瓊脂，迅速于液氮中冷凍，之后于-20℃以下可長(zhǎng)期保藏。本發(fā)明的保藏方法可大大提高酵母菌復(fù)蘇時(shí)的活菌率，并改善了酵母菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，提高了目的蛋白的表達(dá)率，增加了目的產(chǎn)品的產(chǎn)量。本發(fā)明方法可應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域保藏能夠表達(dá)外源基因的酵母宿主，也可應(yīng)用于普通酵母菌的保藏，大大提高生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本，具有較好的市場(chǎng)應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【IPC分類】C12R1/78, C12R1/84, C12R1/865, C12N1/04
【公開號(hào)】CN104928182
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510295396
【發(fā)明人】張星星, 董高峰, 高強(qiáng), 尹衛(wèi)東
【申請(qǐng)人】北京科興中維生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年6月2日