一株高產類胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母及其發(fā)酵培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株既能積累類胡蘿卜素又能富集銅的海洋紅酵母及其有利于類胡 蘿卜素積累的發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于海洋微生物的發(fā)酵及綜合利用技術領域。
【背景技術】
[0002] 類胡蘿卜素是一類呈黃色、橙色或紅色的多烯類化合物，它是自然界中最普遍存 在也是最穩(wěn)定的天然色素，廣泛存在于許多動植物中。類胡蘿卜素作為一種優(yōu)良的食品添 加劑和改善人類營養(yǎng)的營養(yǎng)增補劑，它的優(yōu)良品質和效果，很久以來就被世界各國所公認， 被譽為最有希望的抗氧化劑。目前，類胡蘿卜素被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料添 加劑等行業(yè)中，由于其良好的應用前景及卓越的功能，長久以來倍受人們青睞。
[0003] 從天然食物提取類胡蘿卜素工藝復雜、成本高并且浪費大量食物，因此通過微生 物發(fā)酵法生產類胡蘿卜素已成為研宄熱點，特別是用不產生毒素的紅酵母作為菌種已被廣 泛研宄。紅酵母是酵母菌中的一種，屬于隱形球酵母科，為單細胞真菌。紅酵母形體為卵圓 形或橢圓形，生殖方式為多邊形出芽生殖，能產生明顯的紅色或黃色色素。紅酵母能產生 胡蘿卜素、圓酵母素和紅酵母紅素等多種色素。
[0004] 銅是動物必需的微量元素，對于動物的健康和生長都有很重要的作用。目前，已有 許多試驗證實，在斷奶仔豬飼糧中以硫酸銅作為銅源添加（250mg/kg)的銅可以提高仔豬 的同采食量、日增重以及肉料比。但飼料中添加這種無機態(tài)的硫酸銅也存在很多問題，如豬 吸收率低、與飼糧中其它組分配伍性差、排泄率高、污染環(huán)境等。但是，酵母菌具有鰲合銅粒 子的能力，它除了含有高含量和高吸收率的銅元素外，還具有良好穩(wěn)定性、與飼糧中其它組 分配伍性好、吸收率高、排泄率低、環(huán)境污染小等優(yōu)點。
[0005] 隨著對海洋微生物研宄的加深，人們越來越重視海洋微生物的開發(fā)價值。由于海 洋獨特的環(huán)境，例如高鹽、高壓、低營養(yǎng)、低溫等，造就了海洋微生物有別于陸生微生物的許 多特異性。海洋紅酵母營養(yǎng)要求簡單、生長周期短、菌體營養(yǎng)豐富，有良好的開發(fā)前景。
[0006] 張坤生《利用紅酵母發(fā)酵生產類胡蘿卜素及其功能性質研宄》公開了以紅酵母 為出發(fā)菌株，利用二苯胺為篩選劑，通過紫外誘變，經篩選得到一株高產類胡蘿卜素菌株 Ruv701，搖瓶發(fā)酵產量達到13. 25mg/L，5L罐發(fā)酵類胡蘿卜素產量達到37. 21mg/L，還公布 了通過均勻設計試驗得到促進紅酵母發(fā)酵產生類胡蘿卜素的金屬離子的最佳添加量=K2SO4I. 0 %、MgSO4 · 7H20 0· 05 %、CuSO4 · 5H20 0· 0045 %。
[0007] 發(fā)明專利申請CN104130952《一株膠紅酵母及其在發(fā)酵生產類胡蘿卜素和油脂中 的應用》公開了一株膠紅酵母菌Rhodotorula mucilaginosa，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No. 8926,還公開了該菌株在pH4. 5-8. 0 均可以產生較高的類胡蘿卜素，但是最高產類胡蘿卜素范圍在PH6. 5-7. 5之間，葡萄糖和 蔗糖都可以作為產生類胡蘿卜素的碳源，但是以葡萄糖最好，碳氮比為25-35 : 1，溫度為 27-30°C之間，發(fā)酵96h類胡蘿卜素產量最高，最高產量可達到22. 93mg/L。
[0008] 目前尚未有既能高產類胡蘿卜素又能富集銅的海洋紅酵母的相關報道，本發(fā)明以 期從海洋環(huán)境中分離獲得高產胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母，通過單因素實驗和正交實驗確 定適合于海洋紅酵母產類胡蘿卜素的最優(yōu)培養(yǎng)條件，為工業(yè)生產提供理論依據(jù)，探索一條 海洋紅酵母利用的新途徑。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一株從海洋環(huán)境中分離獲得的既能高產類胡蘿卜素又能 富集銅的海洋紅酵母，并提供其能夠實現(xiàn)高產胡蘿卜素并富集銅的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，為 工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從青島黃海海域海邊采集多種生物樣本，包括海蝦、海 星、海藻等，從中分離海洋紅酵母，并進行該高產菌種積累類胡蘿卜素最優(yōu)條件優(yōu)化，工藝 流程包括：采集海洋生物樣本一海洋紅酵母分離、鑒定一影響類胡蘿卜素產量的單因素試 驗、正交試驗一銅離子馴化培養(yǎng)一最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件確定。
[0011] 本發(fā)明提供一株高產類胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母WYN1，經鑒定屬于紅酵母屬 (Rhodotorula)，所述菌株已于2014年11月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（地址： 中國.武漢.武漢大學，郵編430072)，保藏編號為：CCTCC No :M 2014592,分類命名：海洋 紅酵母 WYNl (Rhodotorula sp. WYNl) 〇
[0012] 本發(fā)明所述海洋紅酵母WYNl在含銅培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)能夠高效生產類胡蘿卜 素，具體的方法是：優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2. 5%，蛋白胨2. 5%，硫酸鎂0. 02%， 磷酸二氫鉀〇. 15%，銅含量300mg/L，氯化鈉20%，其余為水；初始pH為8,接種量10%，搖 床轉速為180r/min，28°C培養(yǎng)24小時后，溫度調整為30°C，pH調整為5,補加一次氮源，即 再按照2. 5%的添加量添加蛋白胨，繼續(xù)發(fā)酵24h。
[0013] 本發(fā)明所述海洋紅酵母WYNl可廣泛應用于食品添加劑工業(yè)，其發(fā)酵生產的類胡 蘿卜素作為一種優(yōu)良的食品添加劑和改善人類營養(yǎng)的營養(yǎng)增補劑，可以被廣泛應用于食 品、醫(yī)藥、化妝品中；另外該菌種還可以應用于飼料工業(yè)中，作為飼料添加劑添加到飼料中， 可以提供B族維生素和銅離子，穩(wěn)定性好、與飼糧中其它組分配伍性好、吸收率高、排泄率 低、環(huán)境污染小，強化飼料的營養(yǎng)價值。
[0014] 有益效果：
[0015] 本發(fā)明從海洋環(huán)境中分離獲得一株高產胡蘿卜素的富銅海洋紅酵母WYN1，通過富 銅馴化等技術手段使其具備在銅離子300mg/L環(huán)境下生長的耐銅特性，通過培養(yǎng)基單因素 實驗、正交實驗及發(fā)酵條件控制等手段，獲得其高產類胡蘿卜素的優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)方法，海洋 紅酵母WYNl發(fā)酵生物量、類胡蘿卜素產量及胞內銅含量分別達到27. 52g/L、25. 12mg/L和 6240 μ g/g干菌。本發(fā)明為工業(yè)生產提供理論依據(jù)，探索一條海洋紅酵母綜合利用的新途 徑。
【具體實施方式】
[0016] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明方法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術 手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā) 明的范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背 離本發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改 動也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017] 實施例1 :海洋紅酵母菌WYNl的獲得及耐銅能力馴化
[0018] (1)將從黃海海邊采集新鮮的海蝦、海星、海藻等生物樣本，置于無菌的YEro培養(yǎng) 基中，挑取紅色或粉紅色圓形菌落，進一步純化培養(yǎng)。根據(jù)各菌種類胡蘿卜素的積累量，篩 選類胡蘿卜素產量高的菌種。其中類胡蘿卜素產量較高的海洋紅酵母WYN1，細胞為卵圓形， 沒有假菌絲；在海水配置的YEro培養(yǎng)基上形成紅色菌落，表面光滑，邊緣整齊；在產孢培養(yǎng) 基上不產子囊孢子，多邊芽殖，無擲孢子；不發(fā)酵糖，不形成類淀粉化合物，不同化肌醇。根 據(jù)上述特點，初步確定屬于紅酵母屬（Rhodotorula)。斜面保存于冰箱中。
[0019] (2)海洋紅酵母WYNl的發(fā)酵培養(yǎng)
[0020] 將菌種轉接到斜面培養(yǎng)基上活化，28°C培養(yǎng)24h后，接種于液體種子培養(yǎng)基中， 28°〇振蕩培養(yǎng)3611得種子液，按10%接種量接入裝有6〇1^發(fā)酵培養(yǎng)基的25〇1^三角瓶中， 28°C，振蕩培養(yǎng)48h(搖床轉速為180r/min)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖2%，蛋白胨1%， 酵母膏1 %，硫酸鎂0. 02 %，磷酸二氫鉀0. 15 %，鹽度20。28°C搖床培養(yǎng)48h，轉速為180r/ min〇
[0021] (3)耐銅能力馴化
[0022] 將海洋紅酵母菌WYNl接種于銅離子含量為50mg/L (硫酸銅配置）培養(yǎng)基中，置于 28°C，180r/min恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)24h。然后從該培養(yǎng)物中取3ml發(fā)酵物接種到不含銅 的麥芽汁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h。反復培養(yǎng)幾代，使酵母在含銅的培養(yǎng)基中生長穩(wěn)定，且數(shù)量不 再增多時，再逐步提高培養(yǎng)基的銅濃度。如此反復便可使得酵母菌能夠適應銅離子含量為 300mg/l的環(huán)境，獲得了耐銅的特性。本發(fā)明經過對海洋紅酵母進行耐銅能力馴化后，能有 效地提高細胞生物量、類胡蘿卜素的產量及酵母的富銅能力。
[0023] (4)細胞生物量的測定
[0024] 將發(fā)酵液3000r/min離心10min，棄上清液，菌體經無菌水洗2~3次后再次離心， 所得菌體置于60°C烘箱中干燥至恒重，準確稱重。
[0025] (5)類胡蘿卜素的提?。?br>[0026] 將Ig干菌體放入IOOmL三角瓶中，加入5mL 3mol/L的鹽酸室溫浸泡lh，沸水浴 4min，迅速冷卻，3000r/min離心15min沉淀為細胞殘澄，用丙酮定容至20mL萃取，得類胡蘿 卜素浸提液。
[0027] (6)類胡蘿卜素的測定
[0028] 將提取液適當稀釋后，用722型分光光度計在475nm條件下測定光吸收值。按下 式計算類胡蘿卜素含量：
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[0030] 式中：A λ _為475nm波長處的吸光度；D為測定試樣時的稀釋倍數(shù)；V為丙酮用量 (mL) ;0. 16為類胡蘿卜素的克分子消光系數(shù);W為紅酵母菌體干重（g)。
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