專利名稱：香蕉枯萎病菌4號生理小種的檢測引物及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個植物病原真菌的檢 測引物及其檢測方法。
背景技術(shù)：
香蕉鐮刀菌枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由鐮刀菌 侵染引起維管束壞死的土傳性病害，病原菌為尖鐮孢霉古巴?；?型[Fwfln謡0，/ or腿 f. cw6mse (E.F.Smith) Snyder et Hansen] (FOC)。病原菌從受傷的根莖侵入，通過寄主維管束 向莖上發(fā)展，并進一步向假葉部蔓延。當(dāng)植株枯死后，病原菌隨 殘體遺留在土壤中，隨著水流或帶菌的農(nóng)具在蕉園內(nèi)再進行自然 傳播，其厚垣孢子可在土壤中存活8 — 10年。由于該菌存活期長， 傳播迅速，尚未有防止該病的特效藥物，因此一旦在香蕉產(chǎn)地發(fā) 病，很可能大面積爆發(fā)將造成重大損失。
尖鐮刀菌古巴?；陀?個生理小種，l號小種(racel)感 染香蕉的栽培種"大蜜哈"[Grosmichel (AAA)]及龍牙蕉 (MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish (AAA)]較抗病，該小種 呈世界分布，在中國大陸已有記錄；2號小種(race2)在中美 洲，僅感染三倍體雜種梭香蕉[Bluggoe (AAB)]，不侵染"大蜜
哈"；3號小種(race3)感染野生的羯尾蕉屬(Heliconia); 4號 小種(race4)能感染幾乎所有的香蕉種類，如Cevendish、"大 蜜哈"、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毀滅性最大，在全世界 范圍內(nèi)尚末找到有效的抵抗4號小種的香蕉品種。
香蕉枯萎病對目前世界香蕉生產(chǎn)已造成重大威脅，因而，如 何控制該病原菌的進一步蔓延成為目前防控香蕉枯萎病的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有防控香蕉枯萎病的不足，提供一種 香蕉枯萎病菌4號生理小種快速檢測引物。
本發(fā)明的另一個目的是提供利用上述引物檢測香蕉枯萎病 菌4號生理小種的方法。
本發(fā)明的香蕉枯萎病菌4號生理小種的檢測引物RF4，其核 苷酸序列如下所示
RF4國1: 5'曙TGCGGGTCCTATTAGTAC-3' RF4-2: 5' -GGTCCTCACACTCCAATC-3'。 利用上述檢測引物RF4檢測香蕉枯萎病菌4號生理小種的 方法，包括如下步驟設(shè)計引物RF4濃度、模板DNA、 dNTPs、 TaqDNA聚合酶及PCR退火溫度梯度，然后進行PCR反應(yīng)，反 應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
上述檢測方法所述PCR反應(yīng)各組分和最佳用量為
模板DNA 1體積
10 XPCR Buffer 2.5體積
Mg2+ 25mmol/l 2.5體積
Taq酶 5U/|iL 滅菌ddH20
DNTPs 25mM
引物RF4-1 引物RF4-2
2體積 1體積 l體積
0.2體積
14.8體積;
所述PCR反應(yīng)程序為94。C4min; 94。C30s， 52。C30s， 72 。C45s，重復(fù)35個循環(huán)；72°C10min。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明采用特
異引物RF4并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了香蕉枯萎病菌4號生理小 種的PCR檢測方法，該方法能夠特異、靈敏、有效的檢測香蕉 枯萎病菌4號生理小種。利用該方法能夠檢測到相當(dāng)于O.ljig的 菌絲，并且從香蕉的根和莖中均能夠檢測到病原物。


圖1為引物RF4擴增的FOC4的核酸序列(R1-F4)圖2為PCR檢測的靈敏度結(jié)果圖3為PCR檢測純病菌結(jié)果圖4為PCR檢測香蕉不同組織結(jié)果圖5為PCR檢測采集于番禺的樣品結(jié)果圖6為PCR檢測采集于中山的樣品結(jié)果圖7為PCR檢測采集于江門、高州的樣品結(jié)果圖8為PCR檢測采集于番禺、中山和江門的吸芽結(jié)果其中，圖1中劃線部分為引物RF4的序列。圖2中，M-DL2000; 1^7:香蕉枯萎病菌4號小種FOC4總DNA稀釋梯度
(10U—IO力)；8:清水對照。圖3中，M: DL2000; 1—15:香 蕉枯萎病菌4號小種FOC4; 16:香蕉枯萎病菌1號小種FOCI; 17.番茄枯萎病菌FOL; 18.西瓜枯萎病菌FOM; 19.苦瓜枯萎病
菌；20.菜豆枯萎病菌；21.棉花枯萎病菌；22.小麥赤霉病菌；23.
膠孢炭疽病菌；24.清水對照。圖4中，
M: DL2000; 1—2:病根；3—4:病莖；5—6:病葉；7:清水 對照；8:健康植株對照。圖5中，M: DL2000; 1—30:樣品 擴增效果；31:清水對照；32:健康植株對照。圖6中，M: DL2000; 1一16:樣品擴增效果；17:清水對照；18:健康植株對照。圖 7中，M: DL2000; 1—4:江門的樣；5—6:高州的樣；31:清 水對照；32:健康植株對照。圖8中，M: DL2000; 1 — 15:番 禺的樣；16 — 23:中山的樣；24—25:江門的樣；26:清水對照； 27:健康植株對照。
具體實施方式
實施例1
1、 PCR體系的建立
設(shè)計引物濃度、模板、dNTPs、 TaqDNA聚合酶及PCR退 火溫度梯度，用以檢測各反應(yīng)條件對擴增效果的影響，具體如
下
模板DNA lul
10 XPCR Buffer 2.5ul Mg2+ (25mrno1/1) 2.5ul
dNTPs (25mM) 2ul
引物RF4-1 lul
引物RF4-2 lul
Taq酶(5U/pL) 0.2ul
滅菌ddH20 14.8ul
總體積 25ul
在冰上配制好反應(yīng)體系，混合均勻后，按如下PCR程序進 行擴增94°C4min; 94°C30s， 52°C30s， 72°C45s，重復(fù)35個循 環(huán)；72。C10min。 4。C保存。
PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5^1PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢 測，再將特異性片段回收、克隆、測序，得到香蕉枯萎病菌4 號生理小種的特異性片段的核酸序列如圖1。圖1中劃線部分為 引物RF4的序列。
利用DNAStar分析軟件(Demonstration system DNASTAR. V5.0 )進行序列處理、分析，然后在NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)上用BLAST程序進行核酸序 列同源性比較。結(jié)果未找到與此序列有同源性的片段。
2、 PCR檢測的靈敏度
取50mg新鮮菌絲抽提總DNA溶于50|al TE中，抽提液用 雙蒸水以IO倍梯度稀釋后進行PCR擴增，電泳結(jié)果(圖2)表 明DNA抽提液在稀釋104倍后仍能擴增出903bp的特異條帶， 即引物RF4能夠檢測出相當(dāng)于O.lpg的菌絲。
3、 引物的特異性
利用引物FR4對香蕉枯萎病菌4號和1號小種及其近似菌株 進行擴增后電泳檢測結(jié)果(圖3)表明引物RF4能擴增FOC4得 到903bp的特異性目的片段，而其它菌株及清水對照未出現(xiàn)條帶， 由此說明引物具有較高的特異性。
4、 PCR檢測香蕉組織
用引物RF4對帶菌的香蕉的不同組織進行擴增時，發(fā)現(xiàn)引物 RF4能有效的對香蕉的根和莖進行檢測，得到特異的擴增產(chǎn)物。 而葉片、清水對照和健康的香蕉組織未得到目的片段。(圖4)
5、 PCR檢測方法的應(yīng)用
用所建立的PCR鑒定體系，對采自廣東省番禺、中山、江 門和高州的具枯萎病典型癥狀的香蕉的根、莖及吸芽進行檢測， 電泳結(jié)果表明在番禺采集的30個樣中，有26個樣擴增出目的 片段(圖5);中山的16個樣中，有14個樣擴增出目的片段(圖 6);江門的4個樣中有3個擴增出目的片段以及高州的2個樣檢 測都為陽性(圖7);從這幾個地方采集的25個芽中，有11個 擴增出目的片段(圖8)。這說明所建立的PCR檢測方法可以有 效的檢測出FOC4，同時也說明在這些地區(qū)存在該病害的危害。
SEQUENCE LISTING
<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>香蕉枯萎病菌4號生理小種的檢測引物及其檢測方法 <130>
<160> 2
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211>
<212> DNA <213>人工引物
<400> 1
RF4-1: 5' -TGCGGGTCCTATTAGTAC-3'
RF4-2: 5' -GGTCCTCACACTCCAATC-3'
<210> 2 <211>903 <212> DNA <213>人工序列 <400>2
tgcgggtcct attagtacag aatcaagagg agctcacccc ttgacaacaa ctgagaagcc 60 tgaaagcaat gggccaagtg ccgggccaca gtacatagcg cctgaccatg ccgctagact 120 gtatgggacg tagatgacgg aaaactgttg ggcaggcagt tagtggctag acaatatggt180
gaaactagag aaaaccttgt attaccatgt cagtaaggct cgcagcgcca gtggcgaggc 240
atgggcttcc gaagaagcct tgcaggaaac gaatgatgag gaatccagca aagctctctg 300
tcaatgccgc tccgacgcag aggagattga agatggcgaa ggtaataatg tagatcgggt 360
tacgtccgat gtagggaatt tcgctgagcg gagagaaaag tagcggccca aatccatctg 420
tagattctca tcagcctcta tcgaaagtcg tgaccgtaat tgagaaagcc cacatccgag 480
aacgtaaagg gcgagaccta acgatgctgc tgtttctgtg acgctgaact cttgcatgac 540
ctgtctatac actgatttag tgtgcatcgt cctcatgtct aagaaagctt tgacgtaccc 600
gacgcttgga acgtaaatcg acgacccgca atagatggta aaagtgtaca agctgtttaa 660
aaagaggttt ggtttcagca aggttcaggc ggtgatgggg atgcgtcaaa cgagttacca "0
gattagggcg gccacggcgg tcttcctcat cgtagaccaa ttgtgaggat tttcagcatc 780
atcgtgcgat ttcctgcgct tgccgtgaga aaaaagaaac aaagactaat agcgtaacac 840
ttgtcactca ccatccaaca agtatgcaat catcctctag ctgaagattg gagtgtgagg 900
acc 90權(quán)利要求
1、香蕉枯萎病菌4號生理小種的檢測引物RF4，其核苷酸序列如下所示RF4-15’-TGCGGGTCCTATTAGTAC-3’RF4-25’-GGTCCTCACACTCCAATC-3’。
2、 利用權(quán)利要求1所述檢測引物RF4檢測香蕉枯萎病菌4 號生理小種的方法，包括如下步驟設(shè)計引物RF4濃度、模板 DNA、 dNTPs、 TaqDNA聚合酶及PCR退火溫度梯度，然后進 行PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢 測。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于PCR反應(yīng)各組分和用量為-模板DNA 1體積10 X PCR Buffer 2.5體積Mg2+ 25mmol/l 2.5體積DNTPs 25mM 2體積引物RF4-1 l體積引物RF4-2 l體積Taq酶 5U/|iL 0.2體積滅菌ddH20 14.8體積;所述PCR反應(yīng)程序為94。C4min; 94°C30s， 52°C30s， 72 。C45s，重復(fù)35個循環(huán)；72。C10min。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一個植物病原真菌的檢測引物及其檢測方法。本發(fā)明采用特異引物RF4并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了香蕉枯萎病菌4號生理小種的PCR檢測方法，該方法能夠特異、靈敏、有效的檢測香蕉枯萎病菌4號生理小種。利用該方法能夠檢測到相當(dāng)于0.1μg的菌絲，并且從香蕉的根和莖中均能夠檢測到病原物。
文檔編號G01N27/26GK101113467SQ200610036319
公開日2008年1月30日 申請日期2006年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月3日
發(fā)明者廖林鳳, 王振中 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)