用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的制作方法
【專利說明】用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003]2001年，Zuk等發(fā)現(xiàn)在脂肪組織存在一類具有多向分化潛力的細(xì)胞，即脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，簡稱脂肪干細(xì)胞。其生物學(xué)性質(zhì)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相類似，并可向脂肪、骨、軟骨、肌肉、內(nèi)皮、造血、肝、胰島和神經(jīng)等多種細(xì)胞方向分化。
[0004]脂肪組織在人體內(nèi)儲量豐富，獲取簡便創(chuàng)傷小，在組織工程、器官修復(fù)、基因治療等方面都有著廣闊的應(yīng)用前景，因此脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞已成為干細(xì)胞領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點。2012年I月，韓國FDA批準(zhǔn)的自體脂肪干細(xì)胞藥物Cuepistem成功上市，用于治療復(fù)雜性克隆氏病并發(fā)肛瘺。同年10月，美國FDA批準(zhǔn)了 Cytori Therapeutics公司脂肪干細(xì)胞對心臟衰竭患者有效性的臨床試驗。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。因此，開發(fā)簡單、快速、高新、安全獲得大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞方法成為當(dāng)務(wù)之急，而目前現(xiàn)有技術(shù)中還未有用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，使得相關(guān)科研工作進(jìn)展緩慢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種使用方便，成本低廉的用于制備獲得大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，包括脂肪保存液、脂肪洗滌液、脂肪分解液、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞消化液、細(xì)胞凍存液；
所述脂肪保存液為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉素2.5?5 μ g/ml 的 DMEM、DMEM/F12、MEM 或 RPM1-1640 培養(yǎng)基；
所述脂肪洗滌液為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉素2.5?5 μ g/ml 的生理鹽水、PBS、D-Hanks 或 HBS ；
所述脂肪分解液為含膠原酶I 0.75?2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPM1-1640培養(yǎng)基;
所述細(xì)胞洗滌液為PBS、D-Hanks或HBSS ；
所述細(xì)胞培養(yǎng)液為間充質(zhì)干細(xì)胞無血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基450ml及其添加物50ml組成，化學(xué)成分限定，含L-谷氨酰胺，不含酚紅和抗生素；
所述細(xì)胞消化液為含Trypsin-EDTA 1.25?2.5mg/ml的PBS、D-Hanks或HBSS溶液； 所述細(xì)胞凍存液為含DMSO 60?200mg/ml的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清生長培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明提供了一種制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。該試劑盒中，脂肪保存液的作用是保證脂肪標(biāo)本在采集之后的運(yùn)輸過程中的活性，并消滅和預(yù)防細(xì)菌、真菌。脂肪洗滌液的作用是洗滌除去脂肪組織的血液細(xì)胞，同時消滅和預(yù)防細(xì)菌、真菌。脂肪分解液的作用是消化脂肪組織，獲得單細(xì)胞懸液。細(xì)胞洗滌液的作用是洗滌獲得的干細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清生長培養(yǎng)基，且化學(xué)成分限定，減少動物來源的病原體感染風(fēng)險，培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相對于使用胎牛血清而言更安全。細(xì)胞消化液的作用是細(xì)胞傳代時，消化貼壁的間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞凍存液的作用是凍存獲得的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明的用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒，可在較短時間(3周內(nèi))獲得大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量可達(dá)19數(shù)量級)，并且具有使用方便，成本低廉，無血清，減少動物來源的病原體感染風(fēng)險，更安全的特點，將在干細(xì)胞臨床試驗及其相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景極為廣泛。
【具體實施方式】
[0009]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所需試劑耗材及實驗儀器等均可通過商業(yè)途徑購得。
[0010]實施例一用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的制備及應(yīng)用一、用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的制備
1、溶液配置
本發(fā)明的用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括以下試劑:
(I)脂肪保存液配置方法:青霉素(品牌Amresco，貨號0242 ) 200mg、鏈霉素(品牌Amresco，貨號 0382) 200mg、兩性霉素(品牌 Amresco，貨號 E437) 5mg，溶于 1000ml DMEM 培養(yǎng)基中0.22um過濾除菌即可。
[0011](2)脂肪洗滌液配置方法:青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg，溶于100ml生理鹽水中0.22um過濾除菌即可。
[0012](3)脂肪分解液配置方法:膠原酶1(品牌sigma，貨號C0130)l g溶于1000ml DMEM培養(yǎng)基中，0.22um濾器過濾除菌即可。
[0013](4)細(xì)胞洗滌液配置方法:PBS，配方為 NaCl 8.50g，Na2HPO4.12H20 3.58g，NaH2PO4.2H20 0.39g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)整pH至7.2-7.4之間，高壓滅菌即可。
[0014](5)細(xì)胞培養(yǎng)液配置方法:無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(品牌Lonza，貨號00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，貨號00192125) 50ml混勻即可。
[0015](6)細(xì)胞消化液配置方法:Trypsin (胰蛋白酶)0.25g，EDTA_2Na 19.728mg溶于上述配好的細(xì)胞洗滌液即PBS 10ml中，混勻，0.22um濾器過濾除菌即可。
[0016](7)細(xì)胞凍存液配置方法:10ml DMSO (品牌sigma，貨號D2650)緩慢加入到90ml上述配好的細(xì)胞培養(yǎng)液即間充質(zhì)干細(xì)胞無血清生長培養(yǎng)基中，輕輕混勻即可。
[0017]2、各組分的分裝
試劑盒的規(guī)格為I次/盒，每盒中各組分的量為:脂肪保存液I瓶(50ml/瓶)，脂肪洗滌液I瓶(250ml/瓶)，脂肪分解液I瓶(50ml/瓶)，細(xì)胞洗滌液3瓶(250ml/瓶)，細(xì)胞培養(yǎng)液4瓶(250ml/瓶)，細(xì)胞消化液I瓶(50ml/瓶)，細(xì)胞凍存液I瓶(50ml/瓶)。
[0018]按照上述試劑量對試劑盒中各組分進(jìn)行分裝，包裝得到用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒。試劑盒-20 V保存，有效期2年，使用之前4 V冰箱內(nèi)或者37 °C水浴解凍，解凍之后4°C保存，一個月內(nèi)用完。
[0019]二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
現(xiàn)用步驟一的試劑盒制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，具體制備方法包括以下步驟，以20ml脂肪為例，所有操縱步驟均在潔凈工作臺完成:
1、脂肪運(yùn)輸:采集20ml脂肪，加入等體積的脂肪保存液，2?8°C恒溫保存在疫苗箱中，48h內(nèi)送至實驗室。
[0020]2、洗滌脂肪:吸棄脂肪保存液，加入等體積脂肪洗滌液，反復(fù)振蕩幾次，靜置后脂肪與脂肪洗滌液自然分層，吸棄脂肪洗滌液，同上，再加入等體積脂肪洗滌液振蕩洗滌2?3次，至下層脂肪洗滌液澄清即可，吸棄脂肪洗滌液，獲得脂肪。
[0021]3、消化脂肪:獲得的脂肪加入等體積的脂肪分解液(預(yù)熱到37°C)，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，37°C，200rpm，消化30?60min，至脂肪呈靡狀即可。
[0022]4、分離SVF (基質(zhì)血管部分):將消化后的靡狀脂肪組織，700g離心lOmin，用移液管自上而下小心除去上層油脂和下層的膠原酶溶液(注意在SVF沉淀上方留下少量的溶液以免擾動沉淀細(xì)胞)，加入細(xì)胞洗滌液混勻，10um濾網(wǎng)過濾，吸取Iml懸液計數(shù)，為2.1 X 17個,400g離心8min,棄上清,獲得SVF。
[0023]5、細(xì)胞種植:根據(jù)SVF細(xì)胞數(shù)，按照1.0父106個/ ml的密度加入細(xì)胞培養(yǎng)液20ml,接種I個T175培養(yǎng)瓶,置于二氧化碳培養(yǎng)箱,培養(yǎng)條件:37±0.5°C, 二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5±0.2%，每隔3d換液一次。
[0024]6、細(xì)胞傳代:7d左右，原代培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)70%?80%融合時，吸棄舊細(xì)胞培養(yǎng)液，力口細(xì)胞洗滌液，靜置lmin，吸棄細(xì)胞洗滌液，加入細(xì)胞消化液，消化時間為1.5?2.5min，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液2?3ml中止消化，反復(fù)吹打瓶底至細(xì)胞大部分脫落，移入50ml離心管中，細(xì)胞計數(shù)，為4.6 X 17個，400g離心8min，棄上清，獲得4.6 X 17個PO代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。按照5.0X 15個/ml加入細(xì)胞培養(yǎng)液，接種到5個T175培養(yǎng)瓶，放入二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，計為Pl代。待3d左右，Pl代細(xì)胞達(dá)80%?90%融合時，同上操作，收獲細(xì)胞，計數(shù)獲得1.9X 18個Pl代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，同上繼續(xù)傳代(每3?5天可傳代一次)，以此類推，直至收獲P3代，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)為3.9 X 19個脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0025]7、細(xì)胞凍存:將上述獲得P3代細(xì)胞懸液，400g離心8min，棄上清，緩慢加入細(xì)胞凍存液，輕輕混勻，然后在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱、代數(shù)及凍存日期；放入凍存盒，_80°C冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)移到液氮長期保持，待使用時復(fù)蘇即可。
[0026]可以看出，用本發(fā)明的試劑盒，在較短時間(3周內(nèi))內(nèi)，由僅僅20ml脂肪，獲得大量的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，表明本發(fā)明的試劑盒可以在較短時間內(nèi)獲得大量脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0027]實施例二用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的制備及應(yīng)用一、用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒的制備
1、溶液配置
本發(fā)明的用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的試劑盒包括以下試劑:
(I)脂肪保存液配置方法:青霉素lOOmg、鏈霉素lOOmg、兩性霉素2.5mg,溶于1000mlDMEM/F12培養(yǎng)基0.22um過濾除菌分裝即可。
[0028](2)脂肪洗漆液配置方法:青霉素lOOmg、鏈霉素lOOmg、兩性霉素2.5mg,溶于100rnl生理鹽水0.22um過濾除菌分裝即可。
[0029](3)脂肪分解液配置方法:膠原酶I 2 g溶于1000ml DMEM/F12培養(yǎng)基中，0.22um濾器過濾除菌即可。
[0030](4)細(xì)胞洗滌液配置方法:PBS，配方為 NaCl 8.50g, Na2HPO4.12H20 3.58g，NaH2PO4.2H20 0.39g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)整pH至7.2-7.4之間，高壓滅菌即可。
[0031](5)細(xì)胞培養(yǎng)液配置方法:無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基(品牌Lonza，貨號00190620) 450ml及其添加物(品牌Lonza，貨號00192125) 50ml混勻即可。
[0032](6)細(xì)胞消化液配置方法:Trypsin 125mg, EDTA_2Na 9.864mg溶于上述配好的細(xì)胞洗滌液即PBS 10ml中，混勻，0.22um濾器過濾除菌即可。
[0033](7)細(xì)胞凍存液配置方法:10ml DMSO緩慢加入到90ml上述配好的細(xì)胞培養(yǎng)液即間充質(zhì)干細(xì)胞無血清生長培養(yǎng)基中，輕輕混勻即可。
[0034]2、各組分的分裝
試劑盒的規(guī)格為I次/盒，每盒中各組分的量為脂肪保存液I瓶(50ml/瓶)，脂肪洗滌液I瓶(250ml/瓶)，脂肪分解液I瓶(50ml/瓶)，細(xì)胞洗滌液3瓶(250ml/瓶)，細(xì)胞培養(yǎng)液4瓶(250ml/瓶)，細(xì)胞消化液I瓶(50ml/瓶)，細(xì)