一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于養(yǎng)殖對蝦疾病防治領(lǐng)域，特別涉及一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲 感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近幾年對我國養(yǎng)殖對蝦疾病的跟蹤研宄和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一種近幾年才開始 在南亞地區(qū)流行的對奸微孢子蟲--奸肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei)在我國 養(yǎng)殖凡納濱對蝦中亦廣泛流行。病理等分析表明，從各地采集的具有發(fā)病癥狀（白便綜合 征）的對蝦體內(nèi)檢測到大量的、處于不同發(fā)育時期的蝦肝腸胞蟲。感染對蝦肝胰腺細(xì)胞內(nèi) 充滿微孢子蟲孢子，細(xì)胞嚴(yán)重空泡化直至碎解，感染蝦生長緩慢、免疫力下降，容易感染病 毒、弧菌等其他病原而暴發(fā)病毒性或細(xì)菌性疾病，經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。由于微孢子蟲是細(xì)胞 內(nèi)寄生生物，而且具有堅硬的幾丁質(zhì)外殼，因此，微孢子蟲的治療方法只在家蠶微孢子蟲等 幾個種類有治療性藥物，且效果欠佳，而對于水產(chǎn)動物微孢子蟲尤其是蝦肝腸胞蟲這種新 發(fā)種類，目前還沒有治療措施的相關(guān)報道。對蝦感染蝦肝腸胞蟲后難以消除，常常終身攜 帶。因此，目前對于蝦肝腸胞蟲的控制應(yīng)該以防為主，盡量在感染早期/潛伏期及早發(fā)現(xiàn)蝦 肝腸胞蟲的感染，實現(xiàn)早期預(yù)警，有效控制病原的感染與傳播，避免蝦肝腸胞蟲病及繼發(fā)性 病毒病、細(xì)菌病的大規(guī)模流行和暴發(fā)。
[0003] 蝦肝腸胞蟲的傳播方式是垂直傳播和水平傳播共存。如果種蝦感染蝦肝腸胞蟲， 則可以通過垂直傳播傳給子代蝦苗，由于蝦苗的培育密度和溫度很高，非常利于微孢子蟲 的增殖和水平傳播，從而使感染蝦肝腸胞蟲的蝦苗數(shù)量迅速增多，因此，種蝦和蝦苗蝦肝腸 胞蟲感染的早期預(yù)警比養(yǎng)殖時期更為重要。分子PCR診斷技術(shù)由于快速、簡便、樣品組織需 要量小，因而，適于對蝦中蝦肝腸胞蟲尤其是種蝦和蝦苗中蝦肝腸胞蟲的快速診斷，但是， 我國國內(nèi)還未見到關(guān)于蝦肝腸胞蟲的正式報道，也沒有關(guān)于我國蝦肝腸胞蟲流行種的分子 檢測技術(shù)，迫切需要設(shè)計針對我國流行種的高度特異而靈敏的引物，為我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝 腸胞蟲的及早預(yù)警和及時預(yù)防提供技術(shù)保障。
[0004] 由于微孢子蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生生物，還具有堅硬的幾丁質(zhì)外殼，不僅影響DNA的提 取效率，而且容易出現(xiàn)較短的片段，因此，國內(nèi)外基于通用引物（擴(kuò)增長片段）的微孢子蟲 的普通PCR檢出率比細(xì)菌、病毒等病原的檢出率要低許多，定量PCR技術(shù)雖然靈敏度有一定 提高，但是檢測成本大幅提高，而且對儀器要求較高。套式PCR技術(shù)通過設(shè)計內(nèi)、外兩對嵌 套引物進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，痕量的模板DNA被富集、擴(kuò)增到可以檢測的量，放大效率極高，且因 為兩對引物擴(kuò)增的目的基因是嵌套的，擴(kuò)增的特異性大大增強(qiáng)，達(dá)到高靈敏度、高特異性擴(kuò) 增目的基因的目的。該法與單對引物的普通PCR相比效率高出很多，與熒光定量PCR相比 又相對簡單易行且成本低廉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期 預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用，該套式引物檢測靈敏度很高且特異性好，適合含量極低和組織 量很小的蝦苗中蝦肝腸胞蟲的監(jiān)測，適用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲微量感染或潛伏感染 的早期監(jiān)測和預(yù)警，具有良好的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明的一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引物，所述套式 引物包括一對外引物EMISF/EMISR和一對內(nèi)引物EMISnF/EMISnR，具體序列如下：
[0007] EMISF ：GCGGTAATTCCAACTCCAAG ；
[0008] EMISR ：TAAGCAGCACAATCCACTCC ；
[0009] EMISnF ：AGTAGCGGAACGGATAGGGA ；
[0010] EMISnR :ACCCAGCATTGTCGGCATAG。
[0011] 所述外引物EMISF/EMISR的擴(kuò)增片段長度為423bp。
[0012] 所述內(nèi)引物EMISnF/EMISnR的擴(kuò)增片段長度為188bp。
[0013] 本發(fā)明的一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引物的應(yīng)用，所 述套式引物應(yīng)用于我國對蝦蝦肝腸胞蟲的分子檢測和疾病預(yù)警。
[0014] 本發(fā)明基于通用引物的廣泛的流行病學(xué)調(diào)查以及普通和超微病理分析表明，感染 我國凡納濱對蝦的蝦肝腸胞蟲為同一個種，SSU rRNA基因序列相同。據(jù)此，設(shè)計了一套基 于我國對蝦蝦肝腸胞蟲種的基因序列的，且擴(kuò)增片段很短的套式引物。
[0015] 有益效果
[0016] 本發(fā)明檢測靈敏度很高且特異性好，適合含量極低和組織量很小的蝦苗中蝦肝腸 胞蟲的監(jiān)測，適用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲微量感染或潛伏感染的早期監(jiān)測和預(yù)警，具 有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1為8尾凡納濱對蝦蝦苗肝胰腺組織DNA的引物擴(kuò)增結(jié)果；其中，前8個泳道為 套式引物擴(kuò)增結(jié)果，后8個泳道為外引物擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0019] 實施例1
[0020] 分別應(yīng)用 EMISF/EMISR 引物和套式引物（EMISF/EMISR 和 EMISnF/EMISnR)對 4 個 蝦池來源的蝦苗樣品肝胰腺組織DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗。
[0021] 外引物（EMISF/EMISR)擴(kuò)增體系和條件：擴(kuò)增體系共25 μ L，由1 μ L組 織DNA模板、0. 5 yL正向外引物EMISF (10 μ M)、0. 5 yL反向外引物EMISR (10 μ Μ)、 12. 5 μ L 2x.GoTaq? Green Master Mix (promega)和 10. 5 μ L 無 DNA 酶水組成。擴(kuò)增條件 為：95°C預(yù)變性 4min，然后 95°C 40s，52°C 30s，72°C 35s 循環(huán) 25 次，最后 72°C延伸 5min。 PCR產(chǎn)物一部分用作內(nèi)引物擴(kuò)增的模板。
[0022] 內(nèi)引物（EMISnF/EMISnR)擴(kuò)增體系和條件：擴(kuò)增體系共25yL，由I yL外引物擴(kuò) 增的PCR產(chǎn)物、(λ 4yL正向內(nèi)引物EMISnF(K) μ M)、0· 4 μ L反向內(nèi)引物EMISnR(K) μ M)、 12. 5 μ L 2xGo f'aq? Green Master Mix (promega)和 10. 7 μ L 無 DNA 酶水組成。擴(kuò)增條件 為：95°C預(yù)變性 3min，然后 95°C 35s，53°C 30s，72°C 20s 循環(huán) 22 次，最后 72°C延伸 5min。
[0023] 取其中一個池的8尾蝦苗的套式引物PCR產(chǎn)物與外引物PCR產(chǎn)物一起經(jīng)I %瓊脂 糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。從電泳圖可以看出，外引物擴(kuò)增結(jié)果全為陰性（泳道 9~16)，而套式引物擴(kuò)增結(jié)果全為陽性（泳道1~8)，條帶明亮而單一。所有陽性結(jié)果經(jīng) 測序驗證，均為蝦肝腸胞蟲。外引物和套式引物對4個養(yǎng)殖池蝦苗的檢測結(jié)果見表1。
[0024] 檢測結(jié)果說明：1、蝦苗中蝦肝腸胞蟲含量極低；2、套式引物（EMISF/EMISR和 EMISnF/EMISnR)的檢測靈敏度很高且特異性好，適合含量極低和組織量很小的蝦苗中蝦肝 腸胞蟲的監(jiān)測，適用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲微量感染或潛伏感染的早期監(jiān)測和預(yù)警。
[0025] 表1外引物和套式引物對蝦苗中蝦肝腸胞蟲的擴(kuò)增結(jié)果
[0026]
【主權(quán)項】
1. 一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引物，其特征在于：所述套 式引物包括一對外引物EMISF/EMISR和一對內(nèi)引物EMISnF/EMISnR，具體序列如下： EMISF：GCGGTAATTCCAACTCCAAG； EMISR：TAAGCAGCACAATCCACTCC； EMISnF：AGTAGCGGAACGGATAGGGA； EMISnR:ACCCAGCATTGTCGGCATAG。2. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引 物，其特征在于：所述外引物EMISF/EMISR的擴(kuò)增片段長度為423bp。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引 物，其特征在于：所述內(nèi)引物EMISnF/EMISnR的擴(kuò)增片段長度為188bp。4. 一種如權(quán)利要求1所述的用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引物 的應(yīng)用，其特征在于：所述套式引物應(yīng)用于我國蝦肝腸胞蟲的分子檢測和疾病預(yù)警。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲感染早期預(yù)警的套式引物及其應(yīng)用，所述套式引物包括一對外引物EMISF/EMISR和一對內(nèi)引物EMISnF/EMISnR，具體序列如下：EMISF：GCGGTAATTCCAACTCCAAG；EMISR：TAAGCAGCACAATCCACTCC；EMISnF：AGTAGCGGAACGGATAGGGA；EMISnR：ACCCAGCATTGTCGGCATAG。本發(fā)明檢測靈敏度很高且特異性好，適合含量極低和組織量很小的蝦苗中蝦肝腸胞蟲的監(jiān)測，適用于我國養(yǎng)殖對蝦蝦肝腸胞蟲微量感染或潛伏感染的早期監(jiān)測和預(yù)警，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104928288
【申請?zhí)枴緾N201510287845
【發(fā)明人】周俊芳, 房文紅, 周紅霞, 王元
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月29日