外顯子 發(fā)生了缺失。第3~5外顯子由2493堿基對(duì)構(gòu)成，因此猜測該缺失為結(jié)構(gòu)內(nèi)（in - frame) 缺失。在該變體3中缺失的部分中，已知在變體1及2中存在2個(gè)核移行信號(hào)。
[0229] 此外，雖然圖中未示出，但通過RT - PCR分析對(duì)這些變體在人iPS細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄 水平進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果是，確認(rèn)了變體2豐富的表達(dá)，而變體1雖然為少量但也確認(rèn)了其的表 達(dá)。此外，明確了變體3的表達(dá)量低。進(jìn)而，雖然圖中未示出，但在小鼠中也確認(rèn)了與這3 個(gè)變體相當(dāng)?shù)膍RNA的表達(dá)。
[0230] 予以說明，序列表中，人TETl的變體1的堿基序列示于序列號(hào)：1，該變體所編碼的 氨基酸序列示于序列號(hào)：2。人TETl的變體2的堿基序列示于序列號(hào)：3,該變體所編碼的氨 基酸序列示于序列號(hào)：4。人TETl的變體3的堿基序列示于序列號(hào)：5,該變體所編碼的氨基 酸序列示于序列號(hào)：6。
[0231] (實(shí)施例3)
[0232] <改變TETl蛋白質(zhì)的表達(dá)1 >
[0233] 將實(shí)施例2中擴(kuò)增出的人TETl (變體2)利用以下所示的方法導(dǎo)入人分化多能性 干細(xì)胞中，嘗試在該細(xì)胞中表達(dá)TETl蛋白質(zhì)。
[0234] 首先，如前所述地以人iPS細(xì)胞的cDNA為模板，利用RT - PCR對(duì)編碼在N末端或 C末端添加有FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。然后使用infusion HD克隆試 劑盒（Takara公司制）將如此制備的2種改變型TETlcDNA分別插入哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體 (pCAG - IRES - Puro,由理研⑶B丹羽研宄室惠贈(zèng)）的XhoI中。
[0235] 然后，使用核轉(zhuǎn)染儀將這些載體分別轉(zhuǎn)染前述人iPS細(xì)胞株（YMhiPSC058sbc6亞 株）中。在該轉(zhuǎn)染中，用人干細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀試劑盒ULonza公司制）將iPS細(xì)胞懸浮，利用 對(duì)人iPS細(xì)胞顯示出最高基因?qū)胄实暮宿D(zhuǎn)染儀的程序：B - 016施以電脈沖。
[0236] 將如此地導(dǎo)入了前述載體的人iPS細(xì)胞邊用嘌呤霉素（1 μ g/ml)篩選邊進(jìn)行培 養(yǎng)，由此分別獲得數(shù)個(gè)克隆的強(qiáng)制表達(dá)N末端一 FLAG標(biāo)簽、C末端一 FLAG標(biāo)簽的TETl的 穩(wěn)定株。并且，對(duì)這些強(qiáng)制表達(dá)改變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞株中的、TETlmRNA及蛋白質(zhì) 的表達(dá)進(jìn)行了調(diào)查。獲得的結(jié)果如圖4及5所示。
[0237] 由圖4及5所示的結(jié)果可知，在任一末端配置了標(biāo)簽的強(qiáng)制表達(dá)株中，TETl的轉(zhuǎn) 錄量均顯著上升（圖5)。但是，頗具意味的是，只有在N末端配置了 FLAG的TETl穩(wěn)定表達(dá) 株在蛋白質(zhì)印跡中可見清晰的TETl蛋白質(zhì)表達(dá)（圖4)。因此暗不了在TETl蛋白質(zhì)的情況 下，N末端部分的序列中存在使本蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的序列。
[0238] (實(shí)施例4)
[0239] <改變TETl蛋白質(zhì)的表達(dá)2 >
[0240] 基于實(shí)施例3所示的結(jié)果，為了鑒定使TETl蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的序列，利用以下所示 的方法對(duì)改變TETl蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
[0241] 首先，制備在TETl蛋白質(zhì)的N末端部分（670氨基酸）的C末端側(cè)融合了 GFP蛋 白質(zhì)的改變TETl蛋白質(zhì)，與前述同樣地使用核轉(zhuǎn)染儀使其在人iPS細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)。予以 說明，這里使用的GFP蛋白質(zhì)（Tag - GFP、evrogen公司制）與通常的GFP蛋白質(zhì)相比，從 翻譯到顯色的時(shí)間縮短，能夠?qū)崟r(shí)觀測融合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)及消失。
[0242] 具體而言，如圖6所示，分別制作了在野生型TETl蛋白質(zhì)的N末端部分融合了 Tag - GFP的蛋白質(zhì)（#93)、在試驗(yàn)性地將從N末端起第2位的氨基酸（S :絲氨酸）置換為 G :甘氨酸的TETl蛋白質(zhì)的N末端部分融合了 Tag - GFP的蛋白質(zhì)（#94)、在如實(shí)施例3中 記載的能夠穩(wěn)定地表達(dá)的TETl蛋白質(zhì)的、N末端添加有FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的N末端 部分融合了 Tag - GFP的蛋白質(zhì)（#95)，并使其分別在iPS細(xì)胞中表達(dá)。予以說明，在這些 細(xì)胞中，包含導(dǎo)入的各改變TET1蛋白質(zhì)和Tag - GFP的融合蛋白質(zhì)所發(fā)出的熒光已確認(rèn)局 限于細(xì)胞的核內(nèi)。并且，為了在單個(gè)細(xì)胞水平對(duì)該熒光信號(hào)進(jìn)行定量解析，對(duì)強(qiáng)制表達(dá)各改 變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞進(jìn)行了 FACS解析。獲得的結(jié)果如圖7所示。
[0243] 由圖7所示的結(jié)果可知，對(duì)作為陰性對(duì)照的不表達(dá)GFP的iPS細(xì)胞測定自身熒光 的信號(hào)值，結(jié)果是幾何平均值為7. 2。此外，對(duì)導(dǎo)入有在野生型TETl蛋白質(zhì)的N末端部分融 合了 GFP標(biāo)簽的蛋白質(zhì)（#93)的iPS細(xì)胞進(jìn)行解析的結(jié)果是，其值為26. 3。與此相對(duì)，頗 具意味的是，僅將第2位的氨基酸由絲氨酸變換為甘氨酸，熒光強(qiáng)度顯著上升（熒光強(qiáng)度： 31. 6、參照?qǐng)D6的#94)。進(jìn)而，如由實(shí)施例3的結(jié)果可以預(yù)測那樣，在使TETl蛋白質(zhì)的第1 甲硫氨酸缺失、在其N末端側(cè)添加 FLAG標(biāo)簽時(shí)，值也顯著上升（熒光強(qiáng)度：37. 7、參照?qǐng)D6 的 #95)。
[0244] 由此明確了 TETl蛋白質(zhì)的從氨基末端起第2位的氨基酸：絲氨酸對(duì)于規(guī)定該蛋白 質(zhì)的穩(wěn)定性而言是必需的。此外，基于該結(jié)果還明確了：實(shí)施例3及4所示的在N末端添加 了 FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可通過將從N末端起第2位的氨基酸由絲氨酸變更為 FLAG標(biāo)簽的從N末端起第2位的氨基酸即天冬氨酸而獲得（參照表示FLAG標(biāo)簽的氨基酸 序列的序列號(hào)：46)。
[0245] (實(shí)施例5)
[0246] <強(qiáng)制表達(dá)改變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞株（TETl - hiPSC)的未分化狀態(tài)的研 宄>
[0247] 如實(shí)施例1所示，保持所謂的相當(dāng)于上胚層狀態(tài)的人的分化多能性干細(xì)胞中通常 幾乎不存在TETl蛋白質(zhì)。因此我們認(rèn)為，實(shí)施例3中制作的、強(qiáng)制表達(dá)改變TETl蛋白質(zhì)的 人iPS細(xì)胞株（TETl - hiPSC)很可能是并不存在于發(fā)生過程中的細(xì)胞狀態(tài)。
[0248] 但是，奇妙的是，雖然未進(jìn)行圖示，但TETl - hiPSC在使用KFA培養(yǎng)基以未分化狀 態(tài)進(jìn)行維持期間，其形態(tài)和增殖速度等與通常的不表達(dá)改變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞并沒 有任何區(qū)別。因此，對(duì)于TETl - hiPSC，利用定量RT - PCR對(duì)通常認(rèn)為與分化多能性干細(xì) 胞的性質(zhì)強(qiáng)烈相關(guān)的設(shè)定轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。獲得的結(jié)果如圖8~ 23的天數(shù)：0所示。
[0249] 由圖8所示的結(jié)果可知，分化誘導(dǎo)前（天數(shù)：0)的TETl - hiPSC中的TETlmRNA的 表達(dá)與作為對(duì)照使用的僅表達(dá)PCAG - IP載體的hiPSC相比，強(qiáng)約4倍，判斷為通常狀態(tài)的 約3倍的表達(dá)為強(qiáng)制表達(dá)?；谠摻Y(jié)果可以判斷：在未分化狀態(tài)下，分化多能性干細(xì)胞的與 自我復(fù)制能力相關(guān)的諸因子〇CT3/4、NANOG及SOX2的mRNA表達(dá)水平在有無 TETl強(qiáng)制表達(dá) 下沒有大的差異（參照?qǐng)D11~13的天數(shù)：0)。
[0250] 已知與上胚層相當(dāng)?shù)木哂衅鹗紤B(tài)型性質(zhì)的分化多能性干細(xì)胞具有此后向外胚層 或中內(nèi)胚樣分化的能力。關(guān)于這一點(diǎn)，頗具意味的是，已經(jīng)明確了表示向外胚層的分化傾向 的標(biāo)志物（神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物：S0X1、NEUROGENIN1、NEUROGENIN2、NEUROD1、ASCL1、PAX6、 ZNF521及0TX2)幾乎不受TETl強(qiáng)制表達(dá)的影響（參照?qǐng)D14~21的天數(shù)：0)。
[0251] 進(jìn)而，表示向中內(nèi)胚層的分化傾向的標(biāo)志物：T及SOX17的表達(dá)狀況在有無 TETl 強(qiáng)制表達(dá)時(shí)差異較大。即，不強(qiáng)制表達(dá)改變TETl蛋白質(zhì)的hiPSC中，確認(rèn)到這些標(biāo)志物的 表達(dá)，但即使在相同培養(yǎng)基中進(jìn)行維持培養(yǎng)，在TETl - iPSC中這些標(biāo)志物的表達(dá)也被抑制 為較低（參照?qǐng)D22及23的天數(shù)：0)。
[0252] 通常，T、SOX17被視為表示已經(jīng)發(fā)生分化的標(biāo)志物，原則上不應(yīng)該在未分化的干細(xì) 胞中表達(dá)。這暗示了：按照常規(guī)方法制作的現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞，與培養(yǎng)基中所包含的、與對(duì) 于向中內(nèi)胚層的誘導(dǎo)所必需的NODAL作用機(jī)制相同的活化素 A過度反應(yīng)，省略了未分化狀 態(tài)而向中內(nèi)胚層分化。換言之，現(xiàn)有的人分化多能性干細(xì)胞為一定程度上向中內(nèi)胚層分化 了的細(xì)胞，嚴(yán)格意義上可能并不是"未分化"。
[0253] (實(shí)施例6)
[0254] < TETl - hiPSC的神經(jīng)分化誘導(dǎo)性的檢驗(yàn)1 >
[0255] 已知在脊椎動(dòng)物的早期發(fā)生中廣泛保守的現(xiàn)象中，分化誘導(dǎo)成神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞是 缺省的（default neurogenesis) (Levine，A.J·等、Dev Biol、2007 年、308 卷、2 號(hào)、247 ~ 256頁）。即，若將早期胚的細(xì)胞分離且不給予其它誘導(dǎo)刺激時(shí)，該細(xì)胞將分化為神經(jīng)系統(tǒng)。 到目前為止，還報(bào)告了小鼠 ES細(xì)胞也遵循該default neurogenesis(Smukler，S.R.等、J Cell Biol、2006年、172卷、1號(hào)、79~90頁）。此外，本發(fā)明人等在以前提出能夠由小鼠 ES 細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的方案時(shí)，主要著于在該缺省通路中"裝載" ES細(xì)胞（Bouhon，LA.等、 8四丨111^8 81111、2005年、68(1 - 2)、62~75頁）。但是，至今沒有關(guān)于使用人的分化多能 性干細(xì)胞時(shí)的缺省將會(huì)如何的報(bào)告。
[0256] 因此，作為檢驗(yàn)TETl - hiPSC的分化能力的一例，對(duì)在小鼠 ES細(xì)胞中發(fā)生 default neurogenesis的狀況進(jìn)行模擬，觀察人iPS細(xì)胞的缺省分化。即，將如前述那樣在 KFA中進(jìn)行維持培養(yǎng)的TETl - hiPSC或hiPSC，為了發(fā)生分化而在中性的CDM培養(yǎng)基中維 持4天，然后將其供于抑制了對(duì)神經(jīng)誘導(dǎo)有利的條件即活化素 A/Nodal的狀況。然后，在所 述向神經(jīng)系統(tǒng)的缺省分化誘導(dǎo)開始后的12天內(nèi)，每4天對(duì)上述人iPS細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子的 mRNA表達(dá)進(jìn)行分析。獲得的結(jié)果如圖8~23所示。
[0257] 已經(jīng)明確，在神經(jīng)被誘導(dǎo)時(shí)，0CT3/4和NANOG的表達(dá)必須迅速減弱（Zheng Wnag 等、Cell Stem Cell、2012年、10卷、440~454頁）。關(guān)于該點(diǎn)，由圖11及12所示的結(jié)果 可知，在開始分化誘導(dǎo)后最初的4天內(nèi)，TETl的強(qiáng)制表達(dá)對(duì)0CT3/4及NANOG的表達(dá)已經(jīng)發(fā) 揮強(qiáng)烈影響。特別是關(guān)于NANOG的表達(dá)性，在TETl - hiPSC中，在4天內(nèi)其表達(dá)減少至百 分之一以下。與此相對(duì)，確認(rèn)到在現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞（hiPSC)中，缺省狀態(tài)下這些因子的表 達(dá)不但不會(huì)減少，反而會(huì)上升。進(jìn)而，雖未進(jìn)行圖示，在這些現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞中，0CT3/4及 NANOG的表達(dá)在此后經(jīng)過約1個(gè)月也僅逐漸變?yōu)樵缙谥档氖种蛔笥摇?br>[0258] 此外，如圖13所示，明確了 TETl - hiPSC中的S0X2的表達(dá)在開始分化誘導(dǎo)后經(jīng) 時(shí)地上升。已知S0X2為在未分化的分化多能性干細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子之一，同時(shí)也是 神經(jīng)的發(fā)生所必需的因子。因此我們認(rèn)為，在使TETl - iPSC分化為神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)，S0X2的 表達(dá)不減少是轉(zhuǎn)向此后表現(xiàn)出的高效神經(jīng)分化的原因之一。另一方面，現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞 (hiPSC)中，S0X2的轉(zhuǎn)錄量相反地顯示出減少的傾向。
[0259] 此外，由圖14~21所示的結(jié)果可知，在TETl - iPSC中確認(rèn)到神經(jīng)分化標(biāo)志物 (S0X1、NEUR0GENIN1、NEUR0GENIN2、NEUR0D1、ASCL1、PAX6、ZNF521 及 0TX2)的顕著的表達(dá)誘 導(dǎo)。另一方面，現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞（hiPSC)中，這些神經(jīng)分化標(biāo)志物的表達(dá)幾乎不被誘導(dǎo)。 此外，特別是開始分化誘導(dǎo)后第12天，TETl - hiPSC中的SOXl的表達(dá)量為不表達(dá)TETl蛋 白質(zhì)的人iPS細(xì)胞（hiPSC)中該因子的約60倍。由此類推，這表示通過TETl蛋白質(zhì)的強(qiáng) 制表達(dá)，人iPS細(xì)胞60倍地容易分化成神經(jīng)細(xì)胞。
[0260] 此外，已知在default neurogenesis中誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞具有前腦（forebrain)的 性質(zhì)。關(guān)于該點(diǎn)，如圖21所示，明確了作為前腦的標(biāo)志物的0TX2通過TETl蛋白質(zhì)的強(qiáng)制 表達(dá)而被顯著地誘導(dǎo)表達(dá)。因此，這表示通過導(dǎo)入TETl蛋白質(zhì)在缺省下能夠誘導(dǎo)成前腦型 的神經(jīng)細(xì)胞。
[0261] 進(jìn)而，如前所述已明確：通過TETl蛋白質(zhì)的強(qiáng)制表達(dá)，NANOG的表達(dá)迅速消失。已 知NANOG的抑制不僅是在前述的向神經(jīng)系統(tǒng)的分化中需要，而且在向幾乎全部的細(xì)胞種類 分化時(shí)都必須抑制該因子。因此，雖然實(shí)施例6中以向神經(jīng)系統(tǒng)（外胚層系）的分化誘導(dǎo) 為例明確了 TETl蛋白質(zhì)的有效性，但如后述的實(shí)施例8所示，通過本發(fā)明的方法或蛋白質(zhì) 獲得的效果并非僅限于外胚層系的分化。即，通過TETl蛋白質(zhì)的強(qiáng)制表達(dá)，引起NANOG的 表達(dá)迅速消失，消除了分化誘導(dǎo)的抑制要因，由此提高了全能性干細(xì)胞的分化多能性。
[0262] (實(shí)施例7)
[0263] < TETl - hiPSC的神經(jīng)分化誘導(dǎo)性的檢驗(yàn)2 >
[0264] 將實(shí)施例6中進(jìn)行分化誘導(dǎo)而獲得的神經(jīng)前體細(xì)胞按照前述那樣重新播種在涂 敷了層粘連蛋白質(zhì)的培養(yǎng)皿中，觀察神經(jīng)突起的形成等成熟過程。獲得的結(jié)果如圖24及25 所示。
[0265] 由圖25所示的結(jié)果可知，在由TETl - hiPSC進(jìn)行分化誘導(dǎo)時(shí)，完全未見神經(jīng)細(xì)胞 以外的細(xì)胞，確認(rèn)了幾乎100%的TETl - hiPSC分化成了神經(jīng)細(xì)胞。與此相對(duì)，由現(xiàn)有的 人iPS細(xì)胞（hiPSC)進(jìn)行分化誘導(dǎo)時(shí)，雖然在圖24中的箭頭所示的位置確認(rèn)到神經(jīng)細(xì)胞的 細(xì)胞體的塊，但其以外均為增殖性的非神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞所占的比率極其有限（參照?qǐng)D 24) 〇
[0266] (實(shí)施例8)
[0267] < TETl - hiPSC向內(nèi)胚層系的分化誘導(dǎo)性的檢驗(yàn)>
[0268] 哺乳類的早期發(fā)生簡單而言是二選一，即，分化為神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等外胚層系的細(xì) 胞系譜還是分化為此外的、作為中胚層（血液、肌肉、骨格系）和內(nèi)胚層（肺、消化器系臟 器）等的共同的祖細(xì)胞系譜即中內(nèi)胚層系的細(xì)胞系譜。因此，除了前述已經(jīng)驗(yàn)證的TETl蛋 白質(zhì)使向外胚層系的分化誘導(dǎo)性提高以外，還利用以下所示的方法對(duì)TETl蛋白質(zhì)使向內(nèi) 胚層系的分化誘導(dǎo)性也提高進(jìn)行了確認(rèn)。
[0269] <人iPS細(xì)胞的內(nèi)胚層系分化誘導(dǎo)法>
[0270] 內(nèi)胚層系的臟器中包括與糖尿病發(fā)病相關(guān)的胰臟、作為代謝?解毒的中樞臟器的 肝臟，因此向這些細(xì)胞系譜的分化誘導(dǎo)的方案的開發(fā)有一些進(jìn)展。因此，此次改進(jìn)了向胰 臟的產(chǎn)胰島素細(xì)胞、即β細(xì)胞的分化方案，即改進(jìn)了 Kevin A D' Amour等、Nat Biotech.、 2006年、24卷、1392~1401頁中記載的方案，實(shí)施了分化為內(nèi)胚層的決定。
[0271] 予以說明，方案的改進(jìn)部分為：將該論文中記載的方案所使用的基本培養(yǎng) 基RPMI置換為本發(fā)明人等在神經(jīng)誘導(dǎo)等中使用的前述CDM培養(yǎng)基，作為誘導(dǎo)物質(zhì)不 再使用Wnt3a蛋白質(zhì)而是使用對(duì)細(xì)胞具有同樣活性、即發(fā)揮同一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的低 分子化合物CHIR99021，不使用用于誘導(dǎo)內(nèi)胚層系細(xì)胞中的細(xì)胞、特別是胰臟細(xì)胞的 Cyclopamine (Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑）。此外，猜測通過所述改進(jìn)，人iPS細(xì)胞會(huì)向接 近肝臟的細(xì)胞種類分化。
[0272] 以下按照步驟對(duì)本分化誘導(dǎo)方法進(jìn)行說明。
[0273] 步驟1 :向內(nèi)胚層系細(xì)胞的確定（4天）
[0274] 將用KFA培養(yǎng)基等維持為未分化狀態(tài)的人iPS細(xì)胞（實(shí)施例3中制作的強(qiáng)制表達(dá) 改變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞株（TETl - hiPSC)或YMhiPSC058sbc6亞株）按照常規(guī)方 法用胰蛋白酶溶液打散。即，使胰蛋白酶作用足夠長的時(shí)間后，用胰蛋白酶抑制劑使該酶反 應(yīng)終止。然后，將其懸浮在向CDM培養(yǎng)基中添加了 ActivinA(100ng/ml)、CHIR99021(3 yM) 及ROCK抑制劑（Υ27632;10μΜ)的分化培養(yǎng)基中，并播種到低粘附培養(yǎng)皿中，由此形成 平均約2000個(gè)細(xì)胞塊。48小時(shí)后，將形成的細(xì)胞塊回收，使細(xì)胞塊再次懸浮在添加了 ActivinA(100ng/ml)的CDM培養(yǎng)基中。進(jìn)一步培養(yǎng)48小時(shí)，由此進(jìn)行細(xì)胞向內(nèi)胚層系的確 定，猜測形成了 definitive endoderm(胚體內(nèi)胚層、標(biāo)志物：S0X17)。
[0275] 步驟2 :原始腸管的形成（4天）
[0276] 將按照前述方法使細(xì)胞命運(yùn)暫時(shí)固定為內(nèi)胚層的細(xì)胞供于此后的分化培養(yǎng)，該分 化培養(yǎng)的目標(biāo)是作為消化器系臟器的原始形態(tài)即腸管。即，對(duì)于由步驟1回收的細(xì)胞塊，置 換為添加了 FGF10(50ng/ml)的CDM培養(yǎng)基，使其在該狀態(tài)下持續(xù)分化4天。其結(jié)果是，猜 測細(xì)胞分化為稱為原始腸管的細(xì)胞（標(biāo)志物：HNF4A)。
[0277] 步驟3 :前腸的形成（4天）
[0278] 原始腸管的細(xì)胞，在近頭部的位置向甲狀腺、肺等臟器分化，在其后部向消化器系 臟器分化。其中，消化器系臟器共同的祖細(xì)胞為前腸。
[0279] 對(duì)于由步驟2回收的細(xì)胞塊，置換為添加了 FGFlO (50ng/ml)及全反式視黃酸 (2 μ M)的CDM培養(yǎng)基，使其在該狀態(tài)下持續(xù)分化4天。其結(jié)果是，猜測細(xì)胞呈現(xiàn)前腸細(xì)胞 (標(biāo)志物：F0XA2)的性質(zhì)。
[0280] 在以上記載的分化誘導(dǎo)方法中，利用現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞、和TETl - iPSC，每4天對(duì) 來自各細(xì)胞的樣品取樣，提取RNA。并且，以該RNA為模板進(jìn)行qPCR，對(duì)表示各分化步驟的 前述標(biāo)志物基因的表達(dá)量進(jìn)行定量。此外，對(duì)NANOG的表達(dá)量進(jìn)行定量，作為表示細(xì)胞的未 分化性的指標(biāo)。獲得的結(jié)果如圖26~29所示。
[0281] 如圖26~29所示，按照常規(guī)方法制作的現(xiàn)有的人iPS細(xì)胞即使不導(dǎo)入TET1，在 該細(xì)胞株中也確認(rèn)到某種程度的內(nèi)胚層分化誘導(dǎo)。另一方面，導(dǎo)入了 TETl蛋白質(zhì)的人iPS 細(xì)胞株中，在確認(rèn)到NANOG的表達(dá)抑制的同時(shí)，還確認(rèn)到內(nèi)胚層系分化標(biāo)志物基因（S0X17、 HNF4A及F0XA2)的顯著表達(dá)誘導(dǎo)。即，這些標(biāo)志物基因的表達(dá)量表明，TETl - hiPSC與現(xiàn) 有的iPS細(xì)胞株相比，向內(nèi)胚層系的誘導(dǎo)效率在所有步驟中均亢進(jìn)約3倍。因此確認(rèn)了，與 前述的向外胚層系的分化能力同樣地，通過導(dǎo)入TETl蛋白質(zhì)，分化多能性干細(xì)胞向內(nèi)胚層 系的分化能力也亢進(jìn)。
[0282] (實(shí)施例9)
[0283] <關(guān)于改變TETl蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)>
[0284] 如上所述，使用在TETl蛋白質(zhì)（全長）的N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的蛋白質(zhì)作為 本發(fā)明的變異型TETl蛋白質(zhì)，并對(duì)其效果進(jìn)行了檢驗(yàn)。因此，對(duì)于本發(fā)明的變異型TETl蛋 白質(zhì)的其它形態(tài)（圖6所示的、使位于從N末端起第2位的絲氨酸殘基被置換為甘氨酸殘 基的人TETl蛋白質(zhì)的N末端部分（包含670氨基酸的蛋白質(zhì)）和GFP標(biāo)簽融合而得的蛋 白質(zhì)（#94))，也利用以下所示的方法確認(rèn)了其能夠提高分化多能性干細(xì)胞的分化能力。
[0285] 首先，制備下述4種人iPS細(xì)胞。
[0286] TETlo/e :強(qiáng)制表達(dá)N末端添加了 FLAG標(biāo)簽的TETl蛋白質(zhì)（全長）的 YMhiPSC058sbc6亞株（實(shí)施例3中制作的強(qiáng)制表達(dá)改變TETl蛋白質(zhì)的人iPS細(xì)胞株）、
[0287] #93 :強(qiáng)制表達(dá)圖6所示的使人TETl蛋白質(zhì)的N末端部分（包含670氨基酸的蛋 白質(zhì)）和GFP標(biāo)簽融合而得的蛋白質(zhì)的YMhiPSC058sbc6亞株、
[0288] #94 :強(qiáng)制表達(dá)圖6所示的將位于從N末端起第2位的絲氨酸殘基置換為甘氨酸殘 基的人TETl蛋白質(zhì)的N末端部分（包含670氨基酸的蛋白質(zhì)）的YMhiPSC058sbc6亞株、 及
[0289] pCAG - IP :導(dǎo)入了 pCAG - IP (空載體）的僅具有耐藥性的YMhiPSC058sbc6亞株 (對(duì)照細(xì)胞株）。
[0290] 予以說明，關(guān)于#93、#94或pCAG - IP，按照與實(shí)施例3中記載的方法同樣的方法 制作編碼各改變TETl蛋白質(zhì)的pCAG - IP載體或pCAG - IP (空載體），然后利用核轉(zhuǎn)染儀 將獲得的載體導(dǎo)入YMhiPSC058sbc6亞株，通過耐藥性進(jìn)行篩選、培養(yǎng)，由此來制備。
[0291] 然后，將這些人iPS細(xì)胞供于前述的神經(jīng)分化誘導(dǎo)，沿用前述方法對(duì)該分化誘導(dǎo) 過程（8天）中的各標(biāo)志物基因的表達(dá)量進(jìn)行解析。獲得的結(jié)果如圖30~32所示。
[0292] 由圖30~32所示的結(jié)果可以明確，可確認(rèn)與在TETl蛋白質(zhì)（全長）的N末端添 加了 FLAG標(biāo)簽的蛋白質(zhì)（TETlo/e)同樣地，通過導(dǎo)入本發(fā)明的變異型蛋白質(zhì)的其它形態(tài)、 即使位于從N末端起第2位的絲氨酸殘基被置換為甘氨酸殘基的人TETl蛋白質(zhì)的N末端 部分和GFP標(biāo)簽融合而成的蛋白質(zhì)（#94)，也能夠提高人iPS細(xì)胞的神經(jīng)分化誘導(dǎo)能力。因 此表明，在利用TETl蛋白質(zhì)的導(dǎo)入提高分化多能性干細(xì)胞的分化能力時(shí)，TETl蛋白質(zhì)的C 末端部分的雙加氧酶所承擔(dān)的去甲基化活性并