一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物及其成骨誘導(dǎo)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物 及其成骨誘導(dǎo)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨缺損指骨的結(jié)構(gòu)完整性被破壞，是臨床常見病。創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清 倉ij、W及各種先天性疾病是導(dǎo)致骨缺損的主要原因。較小的骨缺損(通常指SmmW下），對(duì)于 一個(gè)健康的非吸煙者來說，有可能自行愈合;但骨缺損過大，或者是在較小的骨頭上的骨缺 損，很難完全愈合。運(yùn)就需要手術(shù)的干預(yù)，主要方法包括:骨移植、人工骨和組織工程骨。
[0003] 骨組織工程是指將分離的自體高濃度成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，經(jīng) 體外培養(yǎng)擴(kuò)增后種植于一種天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人體逐步降解 吸收的細(xì)胞支架或稱細(xì)胞外基質(zhì)上，運(yùn)種生物材料支架可為細(xì)胞提供生存的=維空間，有 利于細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氣體交換，排除廢料，使細(xì)胞在預(yù)制形態(tài)的=維支架上 生長，然后將運(yùn)種細(xì)胞雜化材料植入骨缺損部位，在生物材料逐步降解的同時(shí)，種植的骨細(xì) 胞不斷增殖，從而達(dá)到修復(fù)骨組織缺損的目的。因此足夠量的成骨細(xì)胞在骨組織工程中成 為關(guān)鍵因素。如何通過誘導(dǎo)獲得足夠量的成骨種子細(xì)胞，并在誘導(dǎo)過程中維持種子細(xì)胞的 表型特征成為骨組織工程研究中的熱點(diǎn)。
[0004] 脂肪組織是人體儲(chǔ)存最大、容易獲取和應(yīng)用的組織，具有很大的臨床應(yīng)用前景。月旨 肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)是一種成體干細(xì)胞，具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等 多向分化的潛能。目前，間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化是骨組織工程研究中的熱點(diǎn)， 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞可應(yīng)用于治療骨頭壞死、骨折后骨延遲愈合等骨科疾病。通常采用分離自 體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增并向成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后植入體內(nèi)。從抽取的脂肪組織中提取 的間充質(zhì)干細(xì)胞作為介質(zhì)在組織工程應(yīng)用中取得明顯成功。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn)，巧粘附蛋白-IUca化erin-11)能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分 化。巧粘附蛋白-11為巧粘附蛋白家族成員，參與多種生物學(xué)過程，如組織形成、胚胎發(fā)育、 骨組織形成等。成骨細(xì)胞持續(xù)表達(dá)Ca化erin-11，在骨和軟骨中優(yōu)先表達(dá)，控制著間充質(zhì)細(xì) 胞向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化。但單純采用巧粘附蛋白-11對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)， 誘導(dǎo)分化率較弱。因此，對(duì)于能夠提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的技術(shù) 仍有需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物及其成骨誘導(dǎo)方 法。該脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物可顯著提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化能 力。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[000引本發(fā)明提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物，包括巧粘附蛋白-11和富 血小板血漿(PRP)。
[0009]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)將巧粘附蛋白-11和富血小板血漿按一定比例聯(lián)合使用后，可顯著提 高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，增強(qiáng)了成骨誘導(dǎo)分化能力。
[0010]作為優(yōu)選，Wiig/mL計(jì)，巧粘附蛋白-11與富血小板血漿的比例為(0.1~1):(0.05 ~0.1)。
[0011]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，Wiig/mL計(jì)，觀枯附蛋白-11與富血小板血漿的比 例為 0.1:0.1。
[0012]在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，Wiig/mL計(jì)，觀枯附蛋白-11與富血小板血漿的 比例為0.5:0.08。
[001引在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，Wiig/mL計(jì)，觀枯附蛋白-11與富血小板血漿的 比例為1:0.05。
[0014] 作為優(yōu)選，該脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物還包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0015] 作為優(yōu)選，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物中各組分用量為：
[0016] 巧粘附蛋白-11: 0.1~化g/mL
[0017] 富血小板血漿；0.05~O.lmL/mL
[001引基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 補(bǔ)足。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物中各組分用量 為：
[0020] 觀枯附蛋白-11: 0.化g/mL
[0021] 富血小板血漿：0.1 mL/ni;
[0022] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 補(bǔ)足。
[0023] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物中各組分用 量為：
[0024] 觀枯附蛋白-11: 0.5iig/mL
[0025] 富血小板血漿：0.08 mL/mL
[0026] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 補(bǔ)足。
[0027] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物中各組分用 量為：
[002引觀枯附蛋白-11: Uig/mL
[0029] 富血小板血漿：0.05 mL/mL
[0030] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 補(bǔ)足。
[0031] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，富血小板血漿的制備方法為:將靜脈血離屯、，取上 層血漿和白膜層，離屯、，取下層1/4體積的血漿，得到富血小板血漿。
[0032] 本發(fā)明還提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)方法，采用本發(fā)明提供的脂肪間 充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物誘導(dǎo)培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得成骨細(xì)胞。
[0033] 作為優(yōu)選，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為P3~P5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0034] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞為P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。 [0035]作為優(yōu)選，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為14~20天。
[0036]在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間為14天。
[0037] 本發(fā)明提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物及其成骨誘導(dǎo)方法。該組合 物包括巧粘附蛋白-11和富血小板血漿。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0038] 1、本發(fā)明提供的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物可顯著提高脂肪間充質(zhì)干細(xì) 胞的成骨誘導(dǎo)分化能力；
[0039] 2、本發(fā)明采用PRP代替動(dòng)物血清，減少了其應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)和免疫原性，并且可應(yīng)用于 臨床。
【附圖說明】
[0040] 圖1示P3代脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)圖片;其中圖1-1為放大40倍的圖片，圖1-2為放 大100倍的圖片；
[0041] 圖2示P3代脂肪干細(xì)胞的流式鑒定圖片；其中圖2-1、2-2、2-3為對(duì)照組流式鑒定結(jié) 果，2-1示空白對(duì)照，2-2示CD73、HLA-DR的表達(dá)情況，2-3示CD90、CD45的表達(dá)情況；圖2-4、2- 5、2-6為樣品組流式鑒定結(jié)果，2-4示空白對(duì)照，2-5示CD73、HLA-DR的表達(dá)情況，2-6示CD90、 CD45的表達(dá)情況；
[0042] 圖3示各組脂肪干細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)情況，其中，3-1示脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)前茜素紅 染色情況(40X)，3-2示對(duì)照組1脂肪干細(xì)胞采用普通培養(yǎng)基誘導(dǎo)后的茜素紅染色情況(40 X )，3-3示對(duì)照組2脂肪干細(xì)胞采用商品化培養(yǎng)基誘導(dǎo)后的茜素紅染色情況(40 X )，3-4示 實(shí)驗(yàn)組1脂肪干細(xì)胞采用Ca化erin-11誘導(dǎo)后的茜素紅染色情況(40X)，3-5示實(shí)驗(yàn)組2脂肪 干細(xì)胞采用PRP誘導(dǎo)后的茜素紅染色情況(40 X )，3-6示實(shí)驗(yàn)組3脂肪干細(xì)胞采用Ca^erin-11和PRP聯(lián)合誘導(dǎo)后的茜素紅染色情況(40 X )。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 本發(fā)明公開了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物及其成骨誘導(dǎo)方法，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換 和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法 及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0044] 本發(fā)明提供的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)組合物及其成骨誘導(dǎo)方法中所用生物 材料均可由市場購得。
[0045] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0046] 實(shí)施例1
[0047] 1、脂肪干細(xì)胞原代分離
[0048] 待脂肪組織與腫脹液自然分層后吸棄下層液體，加入等體積的生理鹽水清洗脂肪 組織2次，吸棄下方溶液;將脂肪組織分裝至SOmL離屯、管中，每管20mL，每管中加入等體積的 0.5 % I型膠原酶(終濃度為0.25 % )，充分混勻，封口，轉(zhuǎn)移至恒溫空氣搖床中，37°C、200R消 化50min;消化完成后離屯、，15(K)巧m離屯、IOmin;棄去離屯、后的脂肪和脂肪油，每管加入40mL 生理鹽水重懸細(xì)胞，ISOOrpm離屯、5min，棄去上清，用普通培養(yǎng)基(DMEM/F1化10%FBS)重懸 細(xì)胞，并接種至培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90