31] (5)目的蛋白的純化
[0032] 重組融合蛋白被凝血酶切割后，用GST純化試劑盒純化，得到單一的重組細(xì)菌素 LacAB〇
[0033] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，其特征在于，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度為30°C、IPTG 濃度為〇. 8mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為3h，最佳表達(dá)菌株為感受態(tài)大腸桿菌BL21表達(dá)菌株。
[0034] 本發(fā)明采用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定重組細(xì)菌素GST-LacAB蛋白質(zhì)濃度， 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得GST-LacAB蛋白質(zhì)含量是2. 47mg/mL。本發(fā)明采用BCA蛋白質(zhì)濃度 測定試劑盒測定重組細(xì)菌素LacAB蛋白質(zhì)濃度，目的蛋白含量為1. 85mg/mL.
[0035] 抑菌活性分析，純化后重組細(xì)菌素對不同來源指示菌抑菌活性分析表明，干酪乳 桿菌細(xì)菌素抑菌譜廣，不僅對革蘭氏陽性菌致病菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、李斯特菌 具有明顯的抑制作用，對部分革蘭氏陰性致病菌大腸桿菌、沙門氏菌等也具有明顯的抑制 作用。純化重組細(xì)菌素的穩(wěn)定性研宄表明，重組細(xì)菌素具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，耐酸堿穩(wěn)定 性、耐凍融穩(wěn)定性、表面活性劑（SDS、吐溫-20、吐溫-80、尿素、曲拉通X-100)對細(xì)菌素抑菌 活性無影響，EDTA可以增強(qiáng)抑菌作用。純化后的細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最 小抑菌濃度分別為62. 5yg/ml和125yg/ml。
[0036] 因此，本發(fā)明還提供了所述方法制備得到的重組細(xì)菌素LacAB在制備抗菌藥物、 抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑中的應(yīng)用。
[0037] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0038] 本發(fā)明通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達(dá)重組細(xì)菌素LacAB的基因工程菌，提高了 細(xì)菌素LacAB的產(chǎn)量；本發(fā)明通過基因工程法生產(chǎn)細(xì)菌素LacAB，成本低于化學(xué)合成法；且 只需要一次酶切即可得到重組細(xì)菌素LacAB，純化步驟簡單，得率高；本發(fā)明的重組細(xì)菌素 抗菌活性及穩(wěn)定性好，抑菌譜廣，可作為理想的抗生素替代品和人畜生物性藥物、飼料添加 劑、防腐劑、消殺劑等。
【附圖說明】
[0039] 圖1為表達(dá)載體pGEX-4T-l_LacAB構(gòu)建圖；
[0040] 圖2為干酪乳桿菌細(xì)菌素基因PCR結(jié)果圖，其中，M:DL2000Marker，5-陰性對照， 1、2-干酪乳桿菌；
[0041] 圖3為LacAB融合基因PCR原理圖；
[0042] 圖4為干酪乳桿菌LacAB重組細(xì)菌素基因PCR結(jié)果圖，其中，M:DL2000Marker， 1- 陰性對照，2-干酪乳桿菌LacAB基因；
[0043] 圖5為菌落PCR鑒定陽性克隆結(jié)果圖；
[0044] 圖6為陽性克隆酶切鑒定結(jié)果圖，其中，M:DNAMarker，1 :pMD18-T-lacAB重組質(zhì) 粒的EcroRI、SalI雙酶切，2 :pMD18-T-lacAB重組質(zhì)粒的EcroRI單酶切；
[0045] 圖7為菌落PCR鑒定陽性克隆結(jié)果圖，其中，M:DL2000Marker，1、2-干酪乳桿菌細(xì) 菌素；
[0046] 圖8為陽性克隆酶切鑒定結(jié)果圖，M:DL5000Marker，l、2-pGEX-4t-l-LacAB重組質(zhì) 粒的EcroRI、SalI雙酶切，3、4-pGEX-4t-l-LacAB重組質(zhì)粒的EcroRI單酶切；
[0047] 圖9為表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定結(jié)果圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白，1-未誘導(dǎo)的空載體， 2- 誘導(dǎo)的空載體；
[0048] 圖10為IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的篩選結(jié)果圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-未經(jīng)誘導(dǎo)的 樣品；2、3、4、5、6、7_ 分別為經(jīng) 0? 2mmol/L、0. 4mmo/L、0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l.Ommol/L、 1. 2mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)的樣品；
[0049] 圖11為最佳誘導(dǎo)溫度的篩選結(jié)果圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-未經(jīng)誘導(dǎo)的樣品；2、 3、4、5 -分別為 21 °C、2 5 °C、3 0 °C、3 7°C誘導(dǎo)的樣品。
[0050] 圖12為最佳誘導(dǎo)時(shí)間的篩選結(jié)果圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-未經(jīng)誘導(dǎo)的樣品；2、 3、4、5、6_ 分別為誘導(dǎo) 1. 0h、2. 0h、3h、4h、5h的樣品；
[0051] 圖13為最佳表達(dá)菌種的篩選結(jié)果圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1，3,5_分別是感受態(tài)大 腸桿菌BL21，DH5a和T0P10未經(jīng)誘導(dǎo)的樣品；2、4、6_分別為感受態(tài)大腸桿菌BL21，DH5a 和T0P10經(jīng)誘導(dǎo)的樣品；
[0052] 圖14為重組細(xì)菌素的純化結(jié)果圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-純化的誘導(dǎo)空載體； 2-純化的未誘導(dǎo)空載體；3-純化的誘導(dǎo)重組蛋白；4-純化的未誘導(dǎo)重組蛋白；
[0053] 圖15為蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0054] 圖16為LacAB純化蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-純化的 GST-LacAB蛋白；2-凝血酶酶切GST-LacAB蛋白；3-純化的LacAB;
[0055] 圖17為重組細(xì)菌素蛋白的抑菌活性柱狀圖；
[0056]圖18為不同溫度處理對細(xì)菌素抑制金黃色葡萄球菌的抗菌活性的影響柱狀圖， 其中，孔直徑為6.0±0. 2mm，CK為未處理的細(xì)菌素；
[0057] 圖19為細(xì)菌素在不同溫度處理后對大腸桿菌的抑菌活性的影響柱狀圖，其中，孔 直徑為6. 0±0. 2mm，CK為未處理的細(xì)菌素；
[0058] 圖20為細(xì)菌素在不同pH處理后對金黃色葡萄球菌的抑菌活性的影響柱狀圖，其 中，孔直徑為6.0±0. 2mm，CK為未處理的細(xì)菌素；
[0059] 圖21為細(xì)菌素在不同pH條件下對大腸桿菌抑菌活性的影響柱狀圖，其中，孔直徑 為6. 0±0. 2mm，CK為未處理的細(xì)菌素；
[0060] 圖22為細(xì)菌素經(jīng)不同表面活性劑處理后對金黃色葡萄球菌抑菌活性的影響柱狀 圖，其中，Cl-SDS、C2-吐溫-20、C3-吐溫-80、C4-尿素、C5-曲拉通X-100、C6-EDTA、CK-未 添加表面活性劑的空白對照；
[0061] 圖23為細(xì)菌素經(jīng)不同表面活性劑處理后對大腸桿菌抑菌圈直徑的影響柱狀圖， 其中，Cl-SDS、C2-吐溫-20、C3-吐溫-80、C4-尿素、C5-曲拉通X-100、C6-EDTA、CK-未添 加表面活性劑的空白對照。
【具體實(shí)施方式】
[0062] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0063] 實(shí)施例1細(xì)菌素LacAB基因的克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建
[0064] 1材料與方法
[0065] 1. 1材料與試劑
[0066] PMD18-T載體用于構(gòu)建克隆載體，購自大連寶生物科技有限公司；pGEX-4T-l用于 構(gòu)建表達(dá)載體，購自大連寶生物科技有限公司。細(xì)菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；ExTaq、10XExTaqBuffer、DNAMarker和dNTP MTxture均購自大連寶生物公司。
[0067] 1. 2溶液配制
[0068] 氨芐青霉素：將lg氨芐青霉素干粉溶解于20mlddH20中，經(jīng)0. 22m濾膜過濾，分 裝于滅菌EP管中，于-20°C凍存。
[0069] 引物稀釋：引物在invitrogen公司合成，根據(jù)引物的nM數(shù)，將引物用nM/10mL的 滅菌DEPC水稀釋，所得引物濃度即可用于PCR反應(yīng)。
[0070] DEPC水：將lmLDEPC加入999mLddH20中，密封搖床過夜，然后121°C，濕熱滅菌 30min，涼后4°C保存待用。
[0071] 1.3實(shí)驗(yàn)方法
[0072] 1. 3. 1干酪乳桿菌細(xì)菌素（classllb)基因的PCR擴(kuò)增
[0073] 以干酪乳桿菌基因組DNA為模板，根據(jù)文獻(xiàn)和GenBank中登錄（LacA和LacB的登 錄號分別為wp_003596087. 1和wp_003596088. 1)的干酪乳桿菌的細(xì)菌素基因ClassIIb，應(yīng) 用Primer5. 0軟件對細(xì)菌素基因ClassIIb設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引 物由上海生工生物有限公司合成。PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳， 用天根生物試劑公司的離心柱形普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，將其送上 海生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行blast分析。
[0074] 表1細(xì)菌素PCR引物
[0075]
[0076] 1. 3. 2細(xì)菌素基因的克隆及原核表達(dá)載體構(gòu)建
[0077] 本發(fā)明是通過重疊PCR方法獲得細(xì)菌素基因LacAB序列，構(gòu)建克隆載體 pMD18-T-LacAB，進(jìn)而構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-4T-1-LacAB，載體克隆圖譜見圖1。
[0078] 1. 3. 2. 1細(xì)菌素重組基因LacAB的擴(kuò)增
[0079]重疊延伸PCR技術(shù)（genesplicingbyoverlapextensionPCR，簡稱SOEPCR) 由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過 重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。
[0080] 根據(jù)PCR反應(yīng)獲得的細(xì)菌素基因LacA、LacB序列，利用軟件Primer5. 0設(shè)計(jì)帶有 酶切位點(diǎn)特異引物采用重疊PCR方法擴(kuò)增LacAB重組基因序列。具體步驟如下：分兩步反 應(yīng)獲得干酪乳桿菌細(xì)菌素（classllb)基因的的全序列。第一步分別以P1/P2、P3/P4為 引物，ClassIIb-LacA基因和ClassIIb-LacB基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物是Y1和 Y2,進(jìn)行膠回收；第二步，以P1/P4為引物，Y1/Y2模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得重組細(xì)菌素基因 LacAB〇
[0081] 1)引物設(shè)計(jì)
[0082] 根據(jù)載體上多克隆位點(diǎn)上的酶切位點(diǎn)，以及目的片段序列特征，設(shè)計(jì)帶有酶切位 點(diǎn)的引物。具體引物如表2:
[0083] 表2干酪乳桿菌細(xì)菌素（classIIb)基因PCR擴(kuò)增引物
[0085] 2) PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件如下：
[0086] PCR反應(yīng)體系如下：
[0087] ddH20 13,8|iL 1 OxPCR buffer(含Mg2+) 2.()|_iL dNTP Mixture ( 2.5inmol/L ) 2X)[iL DNA模板 1.0(iL 上游引物（10(iniol/L) 0.5(.iL 下游引物（10|iniol/L) 0.5(.iL Taq DNA polymerase ( 2.5U/|aL ) ().2_uL 總體積 20.0j_iL
[0088]第一步PCR反應(yīng)
[0090] 第二步PCR反應(yīng)
[0092] PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用天根生物試劑公司的 離心柱形普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。
[0093] 1. 3. 2. 2細(xì)菌素基因克隆載體的構(gòu)建
[0094] 將純化回收的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pMD18-Tsimple在16°C金屬浴過夜連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（E.coliT0P10)，挑選陽性克隆至5mL液態(tài)含Amp的LB培養(yǎng)液中 37°C搖床培養(yǎng)16-24h，菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定，或提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
[0095] 1)菌液PCR鑒定：以P1/P4為引物，適量菌液為模板，進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性菌落。 PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30個(gè)循環(huán)， 72°C后延伸lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測是否有目 的條帶。
[0096] 2)酶切鑒定：上步得到的菌液提取重組質(zhì)粒，用EcoRI、SalI進(jìn)行單、雙酶切鑒定。
[0097] 將PCR鑒定和酶切鑒定陽性的菌液送往華大進(jìn)行DNA測序。測序正確的菌液，擴(kuò) 大培養(yǎng)，用于提質(zhì)粒備用和保存陽性菌種。
[0098] 1. 3. 2. 3細(xì)菌素基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0099] 1)重組質(zhì)粒pMD18-T_LacAB雙酶切
[0100] 將測序正確的重組質(zhì)粒pMD18-T-LacAB分別用EcoRI、SalI限制性內(nèi)切酶雙酶 切，進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，將目的片段采用AgaroseGelDNAPurifica回收。酶切反應(yīng)條件 是37°C水浴中2h。
[0101] 2)表達(dá)載體pGEX-4T-l雙酶切
[0102] 使用TaKaRa質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pGEX-4T-l，經(jīng)EcoRI、SalI限制性內(nèi)切酶 雙酶切。<